国家高技术研究发展计划(2006AA02A306)
- 作品数：2 被引量：3H指数：1
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- 相关机构：武汉大学更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划更多>>
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- 人补体调节蛋白DAF、MCP在哺乳动物细胞中的共表达及协同作用研究被引量：3
- 2008年
- 利用双启动子构建含人补体调节蛋白DAF和MCP cDNA的双顺反子重组表达载体pcDNA3-DAFMCP-DP,以磷酸钙沉淀法转染NIH3T3细胞,用G418筛选获得NIH3T3 pcDNA3-DAFMCP-DP转化细胞。PCR实验结果显示人补体调节蛋白基因DAF和MCP整合在转化的异源细胞的染色体上。RT-PCR和Western blot印迹实验分别从RNA水平和蛋白质水平证实了人补体调节蛋白分子DAF和MCP在细胞系中皆获得同步表达。检测连续传代30次的NIH3T3 pcDNA3-DAFMCP-DP结果表明人DAF和MCP基因仍稳定整合在细胞基因组中,并未随着传代而丢失,为稳定的转双基因细胞系。补体依赖的细胞毒反应表明,pcDNA3-DAFMCP-DP转染细胞系由于DAF和MCP的共表达获得较DAF或MCP单一表达时更强的保护能力,能更好地抑制人补体依赖的细胞毒作用的发生,保护宿主细胞免受人补体的攻击。以上结果表明,DAF和MCP双基因重组表达载体实现了人补体调节蛋白基因高效转移和高水平共表达,为获得表达多种人补体调节蛋白的理想供体提供了有效策略。而且共表达的DAF和MCP具有协同效应,能更有效地阻止补体激活造成的细胞损伤,在克服超急性排斥反应的基因治疗中具有潜在的临床应用价值。
- 徐莉赵舟宙刘辉蒋达和李文鑫
- 关键词：共表达超急性排斥反应
- 人衰变加速因子DAF基因真核表达系统的构建
- 2008年
- 目的:构建含人补体调节蛋白衰变加速因子DAF分子的cDNA编码区的真核重组表达载体pcDNA3-DAF,转染NIH3T3细胞,建立稳定表达人DAF的NIH3T3细胞模型。方法:将人DAF分子的cDNA编码区克隆到真核表达载体pcDNA3,经酶切和测序鉴定后用磷酸钙沉淀法转染NIH3T3细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的NIH3T3细胞株。用PCR检测人DAF基因在NIH3T3细胞基因组中的整合;用RT-PCR、Westernblot实验和间接免疫荧光技术分别从RNA水平和蛋白质水平检测人补体调节蛋白分子DAF在细胞株中的表达。结果:成功构建了pcDNA3-DAF重组真核表达载体,并建立了稳定转染的NIH3T3细胞株,成功地表达了目的基因。PCR检测连续传代30次的NIH3T3pcDNA3-DAF细胞,结果显示人DAF基因仍稳定整合在异源细胞的染色体上,并未随着传代而丢失,为稳定的转染细胞株。结论:真核表达载体构建和稳定转染NIH3T3细胞株的建立为进一步研究人DAF功能和多种补体调节蛋白的协同作用奠定基础。
- 徐莉赵舟宙刘辉李文鑫
- 关键词：衰变加速因子NIH3T3细胞稳定转染真核表达
