山东省优秀中青年科学家科研奖励基金(BS2011SW026)
- 作品数：15 被引量：45H指数：5
- 相关作者：沈志强王文秀庄金秋苗立中王艳更多>>
- 相关机构：山东省滨州畜牧兽医研究院吉林大学山东农业大学更多>>
- 发文基金：山东省优秀中青年科学家科研奖励基金更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 新型鸭病毒性肝炎病毒巢式RT-PCR检测方法的建立及应用被引量：5
- 2013年
- 根据GenBank上登录的新型鸭病毒性肝炎病毒(N-DHV)基因组序列,设计合成内外2对引物,优化PCR反应条件,建立了检测新型鸭肝炎病毒的巢式RT-PCR方法。结果显示,该方法对Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒(DHV-Ⅰ)、新城疫病毒(ND)、传染性法氏囊病毒(IBDV)、鸭病毒性肠炎病毒(DEV)、鸭细小病毒(DPV)的扩增结果均为阴性;该方法第1次扩增的敏感性是10pg,第2次扩增的敏感性是0.1pg,第2次比第1次扩增的敏感性高100倍。结果表明,建立的巢式RT-PCR方法具有特异性强、敏感性高、重复性好等优点,可以准确快速检测出极低含量的N-DHV,解决了新型鸭肝炎病毒不易在组织病料中检出困难的难题,为新型鸭病毒性肝炎的快速诊断、净化及深入研究奠定了基础。
- 李娇王文秀祖立闯王艳苗立中沈志强
- 关键词：巢式RT-PCR
- 鸭黄病毒SDbz株的分离与初步鉴定被引量：3
- 2013年
- 鸭黄病毒病为近年来新发的鸭病,给养鸭业带来了极大的经济损失。为了深入研究本病的防制,本试验对鸭黄病毒(duck flavivirus,DFV)进行了分离鉴定。取疑似感染DFV的病鸭病料,经细菌分离初步排除细菌感染后,应用RT-PCR检测呈现DFV阳性,处理后将其接种到鸭胚成纤维细胞(DEF)和健康鸭胚上进行病毒分离传代。结果显示,在DEF细胞上第1代48h就开始出现CPE,随着时间的延长CPE更加明显,通常在72～96h产生典型CPE;接种鸭胚每一代均出现死亡,且死亡时间多集中于接种后60～72h,死亡鸭胚胚体水肿、出血、发育不良、胚肝严重出血、肿胀或斑驳样坏死等病变。将病毒DEF细胞和鸭胚分离物应用血凝试验、毒价测定、病毒中和试验、RT-PCR及人工感染试验进行检测鉴定,证明所分离到的病毒为DFV,并将其命名为DFV SDbz株。
- 林初文庄金秋陈金龙王文秀李峰王金良沈志强
- 关键词：鸭黄病毒病毒分离
- 鸭混合感染病例中鸭坦布苏病毒的分离鉴定与E基因序列分析被引量：8
- 2015年
- 对山东省滨州某鸭场2013年送检的疑似鸭瘟或鸭坦布苏病毒感染的临床病料,通过PCR检测进一步确诊为鸭瘟与鸭坦布苏病毒混合感染,并分离到了鸭瘟与鸭坦布苏病毒混合感染毒,为获得单一的鸭坦布苏病毒,利用鸭瘟阳性血清对分离病毒连续进行2次中和试验,接种10日龄SPF胚并连续传3代,收获尿囊液,通过PCR鉴定获得了单一的鸭坦布苏病毒。对分离毒进行ELD50及血凝性等相关测定,并RT-PCR扩增全长E基因,进行序列分析。研究成功得从鸭瘟与鸭坦布苏病毒混合感染的病料中分离到鸭坦布苏病毒,为鸭坦布苏病毒的致病机理等基础性研究以及相关疫苗与诊断试剂的研制奠定了基础。
- 祖立闯苗立中王艳王文秀毕研丽沈志强
- 关键词：鸭瘟病毒E基因
- 一株鸭星状病毒的分离鉴定被引量：5
- 2016年
- 为对发病鸭场找到致病原,并对病原分离鉴定,丰富病原分子流行病学以及为新型诊断试剂和疫苗的研究奠定基础。通过对发病鸭场病鸭临床症状和病理变化观察,鸭胚传代分离培养及一步RT-PCR检测和扩增序列比对分析,最终确定该鸭场发生鸭病毒性肝炎,病原为鸭星状病毒。鸭星状病毒感染导致鸭肝炎的报道不多,但确是导致鸭肝炎的病原之一,应该引起对该病毒的重视。
- 刘吉山李娇祖立闯肖跃强沈志强柳增善
- 关键词：鸭病毒性肝炎
- 鸭坦布苏病毒一步RT-PCR检测方法的建立与初步应用被引量：2
- 2015年
- 为建立一种鸭坦布苏病毒(DTV)快速检测方法,根据Gen Bank上DTV基因组序列,设计1对特异性检测引物,建立了DTV一步RT-PCR检测方法。该方法检测基因A型鸭甲肝病毒、基因C型鸭甲肝病毒、新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒、鸭瘟病毒、减蛋综合征病毒均为阴性。检测的敏感性达3.78 pg RNA。DTV一步RT-PCR检测方法特异性好、敏感性高、重复性好,可用于DTV的分子流行病学调查和临床疾病诊断。
- 祖立闯李娇高鹏王金良王文秀沈志强
- 番鸭细小病毒ZQ分离株非结构蛋白基因的克隆及序列分析被引量：4
- 2013年
- 为了解番鸭细小病毒（MDPV）ZQ株非结构蛋白（NS）基因的分子生物学特性,根据已发表的MDPV基因组分别设计并合成了扩增NS1和NS2基因的特异性引物,应用PCR从MDPV阳性病料中扩增出NS1和NS2基因片段,将其分别连接到pMD 18-T载体上,通过双酶切和PCR筛选出阳性重组质粒。序列分析结果表明,克隆的NS1片段全长1 884bp,编码627个氨基酸,NS2片段全长为1 356bp,编码451个氨基酸。NS1与国内外已发表过的病毒株的核苷酸序列的同源性为98.1%-99.6%,NS2核苷酸序列的同源性为98.2%-100%。系统进化树分析表明,该分离株与福建和广东株亲缘关系最近。
- 王文秀张松林付强沈志强
- 关键词：番鸭细小病毒NS1基因NS2基因
- 猪圆环病毒2型DY株ORF2基因在Sf9昆虫细胞中的表达被引量：1
- 2012年
- 本试验采用PCR方法扩增出完整的PCV2 ORF2基因,并将其克隆到Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的转移载体pFastBac1TM中,获得重组转移载体pFast-ORF2,再将其转化DH10Bac感受态细胞,发生转座反应,通过抗性及蓝白斑筛选获得含有ORF2基因的重组杆粒,通过Cellfectin转染试剂介导将重组杆粒DNA转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒。用该重组杆状病毒感染Sf9昆虫细胞,并通过间接免疫荧光法和Western blotting检测目的蛋白的表达。结果表明,ORF2基因在昆虫细胞中获得表达,表达的蛋白质可被PCV2阳性血清识别,这为进一步研究PCV2亚单位疫苗及诊断抗原奠定了基础。
- 王文秀沈志强王善辉张松林池贤凤夏小静
- 关键词：猪圆环病毒2型ORF2基因
- CDV免疫蛋鸡血清抗体与卵黄抗体的消长规律及其相关性分析被引量：1
- 2013年
- 将犬瘟热病毒（CDV）接种Vero细胞和DF1细胞进行传代并测定其病毒滴度,选取细胞病变出现早、病毒滴度高的Vero细胞毒作为接种病毒抗原免疫蛋鸡。通过每10d进行蛋鸡免疫1次,四免后每30d加强免疫1次的方法进行免疫。免疫前、后每10d采血分离血清和每5d收集鸡蛋提取卵黄抗体,用琼脂扩散法和间接ELISA法测定其抗体水平。结果显示,血清抗体比卵黄抗体的滴度高,两者间呈正相关性,卵黄抗体出现较血清抗体晚3~5d,卵黄抗体在三免后3~5d就已达到较高水平,此时即可开始收集鸡蛋制备卵黄抗体。
- 庄金秋梅建国姚春阳沈志强丁壮
- 关键词：犬瘟热病毒血清抗体卵黄抗体
- Ⅰ型鸭肝炎病毒SYBR-Green实时荧光定量PCR检测方法的建立被引量：5
- 2014年
- 为建立一种快速、特异的Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-Ⅰ)SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,根据GenBank已登录的DHV-Ⅰ型疫苗株C80(DQ864514.3)的非编码区基因序列设计1对特异性引物,经RT-PCR扩增出230bp的靶序列,并克隆到pMD18-T载体上,构建重组质粒;将纯化的重组质粒10倍梯度稀释后作为标准阳性模板,进行SYBR GreenⅠ荧光定量PCR扩增并建立标准曲线,对其敏感性、特异性和重复性进行评价。结果显示,建立的标准曲线的循环阈值与模板浓度呈现良好的线性关系(R2=0.998 2),产物Tm值为87.2～87.9℃,检测灵敏度为71.5拷贝/μL。对55份疑似病料进行检测,荧光定量检测48份为阳性,而用常规PCR方法只能检出39份阳性,ELISA方法只检出30份阳性。这表明所建立的DHV-Ⅰ的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法具有特异、灵敏、快速和重复性良好等优点,可用于临床DHV-Ⅰ感染的快速检测,为DHV的分子诊断、流行病学调查及定量分析奠定了基础。
- 王文秀张倩曲光刚莫玲沈志强
- 关键词：SYBRELISA
- 犬瘟热病毒免疫蛋鸡血清抗体与卵黄抗体消长规律的研究被引量：3
- 2013年
- 试验旨在了解产蛋鸡对犬瘟热病毒（canine distemper virus,CDV）抗原的免疫反应及其血清抗体和卵黄抗体的消长规律,为制备卵黄抗体提供依据。将CDV接种Vero细胞和DF1细胞进行传代并测定其病毒滴度,选取细胞病变出现早、病毒滴度高的Vero细胞毒作为接种病毒抗原免疫蛋鸡。每10 d免疫蛋鸡1次,第4次免疫后每30 d加强免疫1次。免疫前及免疫后每10 d采血分离血清,每5 d收集鸡蛋提取卵黄抗体,用琼脂扩散法和间接ELISA法测定其抗体水平。结果显示,血清抗体比卵黄抗体的滴度高,两者呈正相关性,卵黄抗体出现较血清抗体迟3~5 d,卵黄抗体在第3次免疫后3~5 d就已达到较高水平,此时即可开始收集鸡蛋制备卵黄抗体。
- 庄金秋梅建国姚春阳沈志强丁壮
- 关键词：犬瘟热病毒血清抗体卵黄抗体
