国家高技术研究发展计划(2006AA02A251)
- 作品数：9 被引量：23H指数：2
- 相关作者：沈继龙罗庆礼李雍龙周银娣刘文琪更多>>
- 相关机构：安徽医科大学华中科技大学合肥市第一人民医院更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划国家自然科学基金安徽高校省级自然科学研究基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 抗Sj14-3-3特异性IgY的制备及其诊断日本血吸虫病循环抗原的价值被引量：2
- 2012年
- 目的制备抗重组日本血吸虫信号转导蛋白14-3-3(Sj14-3-3)的鸡卵黄免疫球蛋白(IgY),建立双抗体夹心ELISA诊断体系(IgY-ELISA),探讨用于日本血吸虫病的诊断价值。方法利用Sj14-3-3制备并纯化卵黄抗体IgY和兔多克隆IgG抗体;以IgG为捕获抗体,IgY为检测抗体建立双抗体夹心ELISA诊断方法,检测72例急性血吸虫病患者、128例慢性血吸虫病患者、132例正常人、42例肺吸虫患者、60例华支睾吸虫患者和46例钩虫感染者血清。探讨基于IgY的循环抗原检测的应用价值。结果成功制备并鉴定了抗Sj14-3-3特异性IgY和IgG抗体,建立了双抗体夹心ELISA检测体系;检测急性血吸虫病患者和慢性血吸虫病患者血清的阳性率分别为73.6%和48.4%,正常人血清的阴性率为94.7%;与肺吸虫患者、华支睾吸虫患者、钩虫感染者血清的交叉反应分别为7.1%、6.7%、6.5%。结论建立了基于IgY的双抗体夹心ELISA检测体系,用于日本血吸虫病患者血清的检测具有较高的敏感性和特异性,可用于日本血吸虫病的辅助诊断。
- 罗庆礼周银娣沈继龙
- 关键词：日本血吸虫病循环抗原卵黄抗体
- 日本血吸虫感染兔尿液中具有诊断价值的循环抗原组分分析被引量：2
- 2013年
- 目的分析日本血吸虫感染兔尿液中具有诊断价值的循环抗原(CAg)组分,为建立尿液CAg免疫学诊断方法奠定基础。方法十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析尿液中蛋白抗原组分;甘氨酸盐酸缓冲液(简称甘盐液)解离尿液中循环免疫复合物(CIC),通过抗日本血吸虫可溶性虫卵抗原(Solube egg antigen,SEA)的鸡卵黄免疫球蛋白(IgY),采用免疫印渍技术(Western blot)对解离后的CAg组分进行分析。结果 SDS-PAGE结果显示,正常兔尿液中未见明显蛋白条带:感染兔尿液在未作CIC解离前,有2条主带和3条次带,主带分子量为146kDa和60kDa,次带分子量为108kDa、72 kDa和67 kDa;而利用甘盐液解离感染兔尿液中的CIC后,仅见1条主带和1条次带,分子量分别为68kDa和86kDa。对甘盐液处理后的感染兔尿液作Western blot分析,结果显示其与日本血吸虫感染兔血清和抗日本血吸虫SEA特异性IgY抗体反应的蛋白条带均为68kDa,而与正常兔血清和免疫前IgY反应不产生条带。结论日本血吸虫感染兔尿液中存在具有诊断价值的CAg组分,有望建立基于IgY的尿液CAg免疫学诊断方法。
- 孙成松汪奇志尹晓梅汪峰峰刘晓明张世清汪天平雷家慧李雍龙
- 关键词：日本血吸虫卵黄免疫球蛋白
- IgY-和IgG-ELISA用于日本血吸虫病循环抗原检测的效果比较被引量：2
- 2011年
- 目前，血吸虫病循环抗原的检测敏感度和特异度均不理想，交叉反应有待解决[1]。免疫检测体系中，探针的特异度和亲和力是影响检测效果的主要因素。IgY是卵黄免疫球蛋白的简称，是用特异性抗原免疫产蛋母鸡后母鸡血液中的抗体转移到蛋黄中去的，且是蛋黄中惟一存在的抗体，和哺乳动物的IgG相比，IgY具有高特异、高灵敏度，
- 周银娣温和汪六庆沈继龙
- 关键词：循环抗原检测日本血吸虫病卵黄免疫球蛋白特异度抗原免疫
- 抗肠道病毒71型外壳蛋白1卵黄抗体的制备和鉴定
- 2011年
- 目的 克隆肠道病毒71型（EV71）BrCr株外壳蛋白1（VP1）基因,构建原核表达载体PET28a/VP1,表达VP1重组蛋白,以VP1免疫产蛋母鸡,获得抗VP1的鸡免疫球蛋白（IgY）.方法 培养Vero细胞,利用Vero细胞增殖肠道病毒EV71 BrCr株,提取病毒总RNA,利用RT-PCR扩增出VP1目的基因,目的基因插入克隆载体pGEM-T,提取重组质粒,经BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切获得目的基因,插入原核表达载体pET-28a,重组子同时BamHⅠ,EcoRⅠ双酶切和测序鉴定,转化入感受态工程菌E.coli BL21（DE3）,获得阳性重组工程菌,经IPTG诱导获得表达融合蛋白,试剂盒纯化蛋白,经SDS-PAGE和Western blotting鉴定后,用VP1蛋白免疫开产母鸡,收集鸡蛋,利用EGG stractTM IgY Purification System试剂盒提取卵黄抗体IgY,间接ELISA测滴度,SDS-PAGE和Western blotting验证其表达量和免疫活性.结果 本实验成功扩增出肠道病毒EV71 BrCr株VP1基因,获得了含重组表达质粒pET28a/VP1的阳性工程菌株,经IPTG诱导能高效表达VP1蛋白,VP1经SDS-PAGE和Western blotting鉴定后,利用纯化后VP1蛋白免疫产蛋母鸡,提取的IgY经ELISA 鉴定后其滴度为1：104,SDS-PAGE和Western blotting证实为抗VP1的特异性IgY.结论 成功的从EV71 BrCr株扩增出VP1基因,构建了PET28a/VP1表达载体,获得高效表达融合蛋白,免疫产蛋母鸡后制备高效价抗VP1蛋白的特异性IgY.
- 汪六庆胡元生沈继龙刘宜升
- 关键词：人肠道病毒71型卵黄抗体IGY
- 基于2-DE和蛋白质组技术筛选的日本血吸虫鸟氨酸氨基转移酶的表达及其诊断应用
- 2011年
- 目的扩增并表达日本血吸虫鸟氨酸氨基转移酶(SjOAT),评价其在日本血吸虫病免疫诊断中的应用价值。方法构建pET28a/SjOAT质粒,转化至E.coliBL21,IPTG诱导表达;应用Ni2+亲和层析法纯化OAT;SDS-PAGE和Western blot分析、鉴定表达产物;应用ELISA法检测待检患者血清,比较SjOAT与日本血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)对血吸虫和其它寄生虫感染的检测结果。结果成功克隆表达了SjOAT,Western blot检测结果表明rSjOAT能被血吸虫病患者血清识别;以rSjOAT-ELISA和SjSEA-ELISA分别检测急/慢性血吸虫病患者和其它寄生虫感染者血清的结果经校正χ2检验,差异无统计学意义(P>0.05);对于正常对照者血清和疫区粪检阴性者血清,两种检测方法的特异性比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论 rSjOAT在体外获得表达,用于诊断人血吸虫病具有高度敏感性和特异性。
- 胡梅梅钟政荣罗庆礼方婷娜沈继龙
- 关键词：日本血吸虫ELISA
- 轮状病毒SA11衣壳蛋白VP7的毕赤酵母重组表达及IgY的制备被引量：1
- 2009年
- 目的真核重组表达轮状病毒（rotavirus，RV）SA11株VP7衣壳蛋白并制备、纯化其卵黄抗体（IgY）。方法将SA11标准株在MA104细胞中增殖，收集病毒液。从病毒液中提取RNA，通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）扩增获得SA11株衣壳蛋白VP7的长度为978bp的编码基因，将PCR产物连接到pMD18-T载体上，进行测序。将重组体亚克隆到分泌表达载体pPICZαB中，再将重组体转化人大肠杆菌rop10中，用BstXI线性化酶切重组质粒后电转入毕赤酵母X-33中，进行测序。转染成功的菌落再用甲醇诱导表达，亲和层析法纯化重组蛋白抗原，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）和蛋白免疫印迹（Western blotting）鉴定，用重组蛋白免疫罗曼母鸡，收集鸡蛋，Western blotting鉴定、纯化IgY。结果细胞增殖液中提取的RNA银染可见11个条带，成功构建了含pPICZαB—SAllVP7的毕赤酵母X-35，毕赤酵母X-33分泌的融合蛋白被收集、纯化。毕赤酵母X-33表达的SA11VP7的衣壳蛋白经Western blotting验证与预测蛋白相对分子质量40200相符。从鸡蛋中提取的鸡的IgV验证为抗Vfy7的抗体。纯度可达到95％，1个鸡蛋能产10．2mg的IgY。结论抗重组RVSA11衣壳蛋白VP7和IgY的成功制备为疫苗和诊断试剂的开发奠定了基础。
- 张诗海罗庆礼周银娣李静徐元宏沈继龙
- 关键词：轮状病毒属卵黄免疫球蛋白
- IgY作为抗日本血吸虫治疗性疫苗的初步研究
- 2012年
- 为探讨抗日本血吸虫可溶性虫卵抗原的卵黄免疫球蛋白（anti—SEAIgY）作为抗血吸虫治疗性疫苗的可行性，将实验鼠分为5组，每组8只小鼠，分别在感染后2h、4天、7天和15天进行IgY口服被动免疫，并以PBS作为对照。每鼠经腹部皮肤感染日本血吸虫尾蚴40±1条，感染后6周剖杀小鼠，从门脉中收集成虫和记数肝组织中的虫卵数，计算减虫率和减卵率。并做肝脏连续病理切片观察病变程度，测量并比较各组平均虫卵肉芽肿的体积大小。结果表明，感染后2h、4天、7天和15天IgY被动免疫组的减虫率分别为19．59％、18．19％、32．58％和6．31％；减卵率分别为58．33％、49．56％、82．46％和5．26％。感染后7天IgY被动免疫组的减虫率和减卵率均明显高于其他实验组，并有统计学差异（P〈0．05）。感染后2h、4天、7天和15天IgY被动免疫组的平均单卵肉芽肿体积分别为（38．04±20．97）×10^-3、（30．05±15．42）×10^-3、（21．55±13．35）×10^-3、（39．67±13．87）×10^-3和（40．12±24．13）×10^-3mm^3，血清中血吸虫特异性IgG滴度分别为0．16±0．10、0．30±0．15、0．58±0．15、0．38±0．16。与对照组和其他实验组相比，感染后7天IgY被动免疫组的肝脏平均单卵肉芽肿体积明显减小，血清中日本血吸虫特异性抗体IgG水平明显升高（P〈0．05）。研究结果提示，特异性IgY被动免疫可诱导小鼠产生一定水平的抗血吸虫感染作用，但以感染后第7天的免疫效果最好，其相关机制值得进一步研究。
- 李宋侯晓刘文琪李雍龙雷家慧
- 关键词：卵黄免疫球蛋白被动免疫日本血吸虫
- 抗日本血吸虫SEA鸡卵黄抗体的制备与鉴定被引量：17
- 2007年
- 目的制备特异性抗日本血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)的鸡卵黄免疫球蛋白(IgY)并检测其特异性、敏感性。方法用日本血吸虫SEA经翅膀下静脉和皮下免疫25周龄海兰母鸡4次(首次剂量为60μg/只,加强剂量为30μg/只),每次间隔10d。取免疫前和首次免疫后35d的鸡蛋卵黄,分别用水稀释法提取IgY,BCA法测定蛋白含量,并进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Westernblotting)分析,ELISA检测纯化后IgY特异性和敏感性。分别提取免疫后不同时间的卵黄抗体,观察抗体效价的变化。结果海兰母鸡经SEA首次免疫后35d,每枚蛋经提纯后可得到约61mg抗体,经SDS-PAGE和Westernblotting分析,纯化的IgY有1条主要蛋白带,相对分子质量(Mr)为130000,并可被SEA识别。母鸡初次免疫后第10天,经SDS-PAGE和ELISA分析,鸡蛋卵黄内即有抗体产生,初次免疫后31d效价可达1∶1600。双抗体夹心ELISA结果显示纯化后的IgY有较高的敏感性,可检测到的SEA达2.4ng/ml。结论制备的抗SEA鸡卵黄抗体的特异性和敏感性均较高。
- 王成祖莫红梅程喻力王磊蒋自卫刘文琪李雍龙
- 关键词：卵黄免疫球蛋白日本血吸虫免疫诊断循环抗原
- 重组果糖二磷酸醛缩酶SjLAP和亮氨酸氨基肽酶SjFBPA用于日本血吸虫病的诊断和疗效考核的评价(英文)被引量：1
- 2011年
- 目的评价重组亮氨酸氨基肽酶(rSjLAP)和重组果糖二磷酸醛缩酶(rSjFBPA)抗原用于诊断人血吸虫感染以及疗效考核的价值。方法异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导pET-28a-rSjLAP/BL21和pET-28a-rSjFBPA/BL21表达目的蛋白,组氨酸标签亲和纯化柱纯化rSjLAP和rSjFBPA蛋白。88只BALB/c雌性小鼠随机分为4组,A、B和C组(各21只小鼠),D组(25只小鼠)。A、B和C组分别感染5、15和25条日本血吸虫尾蚴。D组为不感染对照组,在实验的第1天全部处死。A、B和C组在感染后第3、7、10、14、20、30和60天,分别处死小鼠3只,采眼球血制备血清,检测其抗体水平。采用单独或联合rSjLAP和rSjFBPA为抗原,ELISA法检测小鼠血清、急性血吸虫病(38份)和慢性血吸虫病患者(96份)血清中的抗体,以健康人(90份)血清为对照,同时检测华支睾吸虫病(33份)、卫氏并殖吸虫病(40份)和钩虫病患者(37份)血清,并检测急性血吸虫病患者吡喹酮治疗(60 mg/kg,2次/d×2 d)后1年的血清(36份)、慢性血吸虫病患者吡喹酮治疗(剂量,疗程同前)后1年(36份)和2年(64份)的血清。结果 BALB/c小鼠在感染后第10天,rSjLAP和rSjFBPA单独或联合使用均可检测到小鼠血清中的IgG抗体;B组(0.535±0.053,0.595±0.033,0.696±0.104)和C组(0.548±0.060,0.608±0.063,0.621±0.090)早期抗体水平明显高于A组(0.415±0.038,0.455±0.056,0.498±0.077)(P<0.05)。用rSjLAP为抗原可检测急性血吸虫病和慢性血吸虫病患者血清,阳性率分别为97.4%(37/38)和87.5%(84/96)(P>0.05);用rSjFBPA为抗原检测,其阳性率分别为94.7%(36/38)和88.5%(85/96)(P>0.05);用rSjLAP和rSjFBPA联合为抗原检测,则其阳性率分别为94.7%(36/38)和85.4%(82/96)(P>0.05)。rSjLAP或联合抗原的特异性均为96.7%(87/90),而rSjFBPA的特异性为97.8%(88/90)。给予吡喹酮治疗后,rSjLAP和rSjFBPA单独或联合使用检测急性血吸虫病血清(0.236±0.212,0.287±0.191,0.235±0.120)和慢性血吸虫病患者(0.266±0.124,0.261±0.14
- Faustina Halm-Lai罗庆礼钟政荣宋晓蓉陈兆武王林胡梅梅储德勇沈继龙
- 关键词：日本血吸虫病免疫诊断亮氨酸氨基肽酶
