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骨髓基质干细胞／胶原凝胶复合物原位构建工程化肝组织被引量：3: 2008年; 目的探讨大鼠骨髓基质干细胞（BMSCs）与胶原凝胶材料复合后原位植入肝内的组织再生潜能。方法将来源于雄性SD大鼠的BMSCs与液态鼠尾胶原复合后，原位植入雌性大鼠肝组织挖除部位，分别于植入后1、2周取材。采用苏木素-伊红（HE）染色对植入部位组织学特征进行观察，并采用免疫组化染色和FISH方法分别对白蛋白、CK19及SRY基因进行检测。结果BMSCs与胶原凝胶复合后，细胞均匀的分布在整个BMSCs／胶原复合物中。体内植入后1周，观察到植入细胞分化出圆形、多角形等细胞形态。植入后两周，组织学显示植入部位形成肝细胞样的细胞集落，免疫组化染色显示这些细胞抗白蛋白抗体染色（Alb）阳性。此外，植入部位还形成由上皮样细胞围成的管状结构，抗CK19抗体染色提示这些上皮样细胞为胆管上皮细胞。原位杂交证实植入部位细胞主要来自植入的雄性大鼠的骨髓基质干细胞。结论BMSCs与胶原复合后原位植入肝内可形成类肝样组织。该方法经进一步研究有望用于肝脏病损的修复治疗。; 赵云山张博峰吴欣刘巨超张兰李力李荣徐迎新; 关键词：骨髓基质干细胞胶原凝胶

以胶原凝胶为支架原位构建可注射型工程化肝被引量：3: 2008年; 背景:为了解决肝移植供体的不足,最具潜力的肝组织工程技术悄然兴起,为肝组织的修复与功能重建开辟了新的前景。目的:探索一种以新生大鼠肝细胞为种子细胞,以胶原凝胶为支架材料,可原位注射的工程化肝组织构建方法。设计、时间及地点:以动物为观察对象的实验方法探索,于2007-03/2008-02在解放军总医院普通外科研究所完成。材料:成年雌性SD大鼠及出生24h以内的雄性新生SD大鼠。方法:以胰酶消化法获取新生大鼠肝细胞,以PKH26标记后与液态胶原复合,采用注射方法植入大鼠肝脏。主要观察指标:于肝细胞/胶原凝胶复合物植入当天及植入后第3,7天序贯取样、切片,分别行苏木精-伊红染色和白蛋白免疫组织化学染色后对"类肝组织"进行形态学观察,并观察植入细胞的示踪荧光。结果:①以胶原为基质构建的工程化肝组织能方便地植入到肝脏。②荧光显微镜观察到移植区域主要由PKH26阳性细胞组成。③苏木精-伊红染色显示,移植区域肝细胞在胶原凝胶中可存活、生长。④免疫组织化学染色证实植入肝细胞能够表达白蛋白。结论:以新生大鼠肝细胞/胶原凝胶为基础构建可原位注射的工程化肝组织是可行的,这种方法对于发展以组织工程为基础的原位肝脏重建具有良好的应用前景。; 张博峰赵云山郭振华刘巨超张兰徐飞李荣徐迎新; 关键词：胶原生物医学工程

以胶原凝胶为支架构建可植入工程化肝组织的实验研究被引量：12: 2007年; 目的探讨肝细胞与液态Ⅰ型胶原复合构建可植入的工程化肝组织的可行性。方法SD 大鼠肝细胞与液态Ⅰ型胶原及 DMEM 复合,形成肝细胞/胶原凝胶复合物。该复合物被接种在培养板中培养,采用相差显微镜和 HE 染色方法对培养肝细胞形态特征进行观察,并采用 MTT 法和免疫组化染色方法分别对肝细胞的活性和功能进行检测。肝细胞/胶原复合物同时被植入皮下腔中观察肝细胞的分化及工程化肝组织的形成情况,采用 HE 染色和免疫组织化学染色方法对植入的工程化肝组织进行评价。结果肝细胞与液态Ⅰ型胶原复合后形成凝胶状复合物,可见肝细胞均匀分布在整个复合物中,呈三维立体生长。在整个体外培养过程中,肝细胞始终保持圆形的形态;肝细胞在培养初期活性稍有下降,直至第7天时仍然保持活性的87%,之后随培养时间延长而活性逐渐降低。经过2周培养,肝细胞仍具有白蛋白的合成功能。皮下植入后1周,肝细胞/胶原复合物形成工程化灶性肝组织,免疫组化染色证实这种工程化的肝组织具有白蛋白的合成功能。结论采用胶原凝胶作为肝细胞生长和分化的支架可在体内构建类肝样的工程化肝组织。这种可植入的工程化肝组织提供了一种基于肝细胞治疗的新途径,并有望用于损伤肝组织修复和重建。; 赵云山徐迎新张博峰吴欣刘巨超张兰唐利安黄志强; 关键词：肝细胞皮下植入

肝组织工程支架评价方法研究被引量：2: 2009年; 目的:以人肝细胞系HepG2作为种子细胞,建立一种细胞支架评价方法,为肝组织工程筛选合适支架。方法:将HepG2细胞接种在生物可降解聚合物支架——聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)、壳聚糖(3%CS)和丝素(2%SF)上,体外常规培养;采用四唑盐(MTT)比色法、HE染色和尿素氮检测试剂盒对接种在支架上HepG2细胞的生长、分布及功能情况进行检测。结果:培养在3种支架上的HepG2细胞均维持增殖状态,相比之下,丝素支架上的细胞增殖较快,而PLGA和壳聚糖支架上的细胞增殖相对缓慢;培养至第7d时,组织学检测显示丝素支架上的HepG2细胞分布均匀,数量最多;而在PLGA和壳聚糖支架上只能发现少量细胞;细胞功能检测显示丝素和PLGA支架上的尿素合成能力下降缓慢,而壳聚糖支架上的尿素合成能力快速下降。结论:3种支架均具有比较好的生物相容性;相比较而言,丝素更适合作为肝组织工程支架;该方法可用于批量筛选肝组织工程支架。; 刘巨超赵云山刘广民张博峰佘振定徐迎新; 关键词：PLGA 壳聚糖丝素 HEPG2细胞

用新生大鼠肝细胞体外构建工程化肝组织被引量：8: 2008年; 目的:在供体肝短缺的情况下,构建可植入的工程化肝组织具有重要的临床意义。实验尝试以新生大鼠肝细胞为种子细胞体外构建工程化肝组织,以期进一步的体内植入。方法:实验于2007-04/08在解放军总医院普通外科研究所完成。①实验材料:SPF级、出生24h以内的雄性SD新生大鼠。②实验过程:采用胰酶消化法获取新生大鼠肝细胞;以2×L-DMEM液(添加地塞米松10μg/L、表皮生长因子20μg/L、肝细胞生长因子40μg/L及胰岛素0.04U/mL)与液态鼠尾胶原等比例混合;再将肝细胞与胶原凝胶复合构建细胞/凝胶复合物,接种于培养板进行培养。③实验评估:培养后第1,3,5,7,9天,采用相差显微镜观察、四甲基偶氮唑盐比色法、苏木精-伊红染色和免疫组织化学染色分别对工程化组织的生长情况及组织形态特征进行观察,并对工程化组织的白蛋白合成功能及尿素的代谢水平进行评价。结果:①肝细胞与胶原凝胶复合后,细胞均匀的分布在复合物中。在整个培养过程中,肝细胞保持着稳定的细胞形态。②四甲基偶氮唑盐检测显示肝细胞活性在生长初期平缓下降,直至第5天时仍然保持75%的细胞活性,之后快速下降。③体外培养5d后,相差显微镜下观察显示肝细胞在胶原凝胶中呈三维立体生长,并保持肝细胞胞体圆形,核大而圆的特异形态;免疫组织化学证实这些肝细胞抗白蛋白抗体染色呈强阳性。④对培养上清中白蛋白和尿素的含量测定表明胶原凝胶中的肝细胞在培养初期保持着稳定的代谢合成功能。结论:用新生大鼠肝细胞及胶原构建出一种有功能的工程化肝组织模型,这种模型可以应用于今后的工程化肝组织研究。; 张博峰赵云山刘巨超张兰李荣徐迎新

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国家自然科学基金(50573091)

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