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抗人AFP单链抗体与藻胆蛋白融合蛋白的构建、表达与活性分析: 2016年; 目的:构建多基因表达载体,在大肠杆菌中同时表达AFP单链抗体(sc Fv)和蓝藻别藻蓝蛋白α亚基脱辅基蛋白(apc A)组成的融合蛋白(sc Fv-apc A)、藻胆蛋白裂合酶(cpc S)及藻红蛋白生物合成酶(Ho1和peb S),获得共价结合藻红胆素的融合蛋白(sc Fv-apc A-PEB)。方法:利用融合PCR将sc Fv和apc A基因连接起来,形成sc Fv-apc A融合基因,并将该融合基因与cpc S克隆到表达载体p CDFDuet-1中;将Ho1和peb S基因克隆到表达载体pRSFDuet-1中。将两种载体共转化到大肠杆菌中,IPTG诱导重组蛋白表达,经亲和层析获得重组蛋白,通过光谱学分析和抗体竞争性抑制法,测定重组蛋白的生物学活性。结果:成功表达融合蛋白sc Fv-apc A-PEB,分子质量约为45k Da,与理论值相符,其最大吸收峰为549.5nm,最大荧光发射峰为560nm,竞争抑制ELISA法初步鉴定活性,竞争抑制率达到48%。结论:利用大肠杆菌表达系统,获得了同时具有荧光特性和免疫学活性的重组蛋白。; 陈华新武静赵瑾姜鹏; 关键词：单链抗体别藻蓝蛋白融合蛋白

蓝藻藻胆体的体外组装研究进展被引量：8: 2016年; 光合作用的第一步是高效地捕获和传递光能.藻胆体位于蓝藻和红藻细胞的类囊体膜外朝向基质一侧,结构上主要由藻胆蛋白和连接蛋白构成,且功能上以不低于98%的效率捕获和传递光能至PSⅡ.3种类型的藻胆蛋白单体的结构类似,由于含有不同数目和种类的色素分子以及藻胆蛋白结构的细微差别导致光能最大吸收波长不同.藻胆蛋白以不同寡聚形式,加上连接蛋白的作用,依靠氢键和极性相互作用,自发组装为高度有序的完整藻胆体结构.科学家尝试体外合成和组装藻胆体,但目前只达到三聚体形式,六聚体及更高级组装远未解决.本文主要从生物组合合成的角度,综述了体外从头合成和组装完整藻胆体的历程和进展,并展望了迄今完成的最高级别的重组别藻蓝蛋白三聚体的应用.; 马建飞林瀚智秦松; 关键词：捕光复合物藻胆体组合生物合成体外组装

重组别藻蓝蛋白(holo-apcB)的抗氧化活性研究被引量：2: 2014年; 本研究利用代谢工程技术原理在重组大肠杆菌表达合成了嗜热聚球藻(Thermosynechococcus elongatus BP-1)别藻蓝蛋白β亚基(holo-apcB),并利用亲和层析的方法对holo-apcB进行了分离纯化。SDS-PAGE电泳胶图显示,holo-apcB分子量与18.4 ku的蛋白条带相近,与理论分子量吻合。光谱学分析结果显示,其最大吸收峰为615 nm,最大荧光发射峰为640 nm,与天然别藻蓝蛋白β亚基具有相同的分子量和光谱学性质。在55℃条件下,holo-apcB的半衰期高达31.9 h。以嗜热聚球藻天然别藻蓝蛋白(APC)及脱辅基别藻蓝蛋白β亚基(apo-apcB)为参照,分析了holo-apcB的抗氧化活性。结果显示,holo-apcB具有最强的抗氧化能力,其清除羟自由基和氢过氧自由基半数抑制浓度(IC50)分别为224.9μg/mL和20.6μg/mL,显著低于apo-apcB和天然APC的IC50,这表明holo-apcB中的藻蓝胆素也参与了抗氧化过程。; 周孙林陈华新姜鹏李富超唐东山; 关键词：别藻蓝蛋白抗氧化活性自由基

藻胆蛋白在大肠杆菌中的重组表达及其光谱学性质与抗氧化活性研究被引量：1: 2017年; 在大肠杆菌中进行了藻胆蛋白的重组表达,对重组藻胆蛋白进行了分离纯化,测定了重组藻胆蛋白的光谱学性质和抗氧化活性。结果表明,以IPTG为诱导物时,当菌液OD_(600)为0.95时,加入终浓度为0.1 mmol/L的IPTG和5.0 mmol/L的5-氨基酮戊酸(ALA),在18℃条件下诱导24 h重组蛋白可获得较好表达效果,表达量达149.5 mg/L;以乳糖为诱导物时,当菌液OD_(600)为1.2时,加入终浓度为1.0 g/L的乳糖和5 mmol/L的ALA,在18℃条件下诱导26 h重组蛋白可获得较好表达效果,表达量达102.9 mg/L。重组藻胆蛋白最大吸收峰位于550 nm,最大荧光发射峰位于562 nm,相对于IPTG诱导表达的重组藻胆蛋白,经乳糖诱导表达重组藻胆蛋白,其550 nm处具有较强的光吸收,562 nm处具有较高荧光强度,同时也具有较高的羟基自由基和超氧阴离子的清除能力。; 朱晓文陈华新齐宏涛姜鹏李富超李荣贵; 关键词：藻胆蛋白乳糖 IPTG 抗氧化活性

Genetic transformation of marine cyanobacterium Synechococcus sp.CC9311(Cyanophyceae) by electroporation被引量：1: 2013年; Synechococcus sp.CC9311 is a marine cyanobacterium characterized by type IV chromatic acclimation(CA).A genetic transformation system was developed as a first step to elucidate the molecular mechanism of CA.The results show that Synechococcus sp.CC9311 cells were sensitive to four commonly used antibiotics:ampicillin,kanamycin,spectinomycin,and chloramphenicol.An integrative plasmid to disrupt the putative phycoerythrin lyase gene mpeV,using a kanamycin resistance gene as selectable marker,was constructed by recombinant polymerase chain reaction.The plasmid was then transformed into Synechococcus sp.CC9311 via electroporation.High transformation efficiency was achieved at a field strength of 2 kV/cm.DNA analysis showed that mpeV was fully disrupted following challenge of the transformants with a high concentration of kanamycin.In addition,the transformants that displayed poor growth on agar SN medium could be successfully plated on agarose SN medium.; 陈华新林瀚智姜鹏李富超秦松; 关键词：ELECTROPORATION

基因工程大肠杆菌生产重组别藻蓝蛋白(holo-SA-apcA)发酵条件优化被引量：2: 2016年; 利用Design-Expert 8.0软件,对大肠杆菌产重组别藻蓝蛋白(holo-SA-apc A)的发酵条件进行优化。首先运用Plackett-Burman两水平设计,对影响重组蛋白表达量的8个因素进行评价,选择有显著影响的3个因素,即p H值、诱导温度、接种量。在此基础上,再用最陡爬坡实验快速逼近以上3个因素的最大响应区域,最后经过Box-Behnken设计和响应面分析,通过求解回归方程得到最优条件为:p H 8.0、诱导温度18℃、接种量4%。在此条件下重复发酵实验3次,重组蛋白表达量达52.3 mg/L,与预测值基本一致。; 杨玉莹陈华新徐云峰姜鹏赵瑾陈亮; 关键词：别藻蓝蛋白大肠杆菌 PLACKETT-BURMAN设计

响应面法优化重组大肠杆菌生物合成别藻蓝蛋白(holo-apcA)的发酵条件被引量：4: 2015年; 采用响应面法对重组大肠杆菌生物合成别藻蓝蛋白（holo-apc A）的发酵条件进行优化,提高了蛋白的表达量。以对重组别藻蓝蛋白α亚基在大肠杆菌中表达量影响较大的几种因素用于中心组合设计;中心组合设计试验结果表明诱导温度、培养基初始p H和诱导时机对诱导结果影响显著;经Design Expert 8.0软件优化后的最佳诱导条件为：诱导温度28℃,培养基初始p H 8.5,IPTG终浓度0.1 mmol/L,以及诱导时机3 h。最后验证试验得到的蛋白表达量在已有文献报道结果的基础上提高了70%-580%。中心组合设计-响应面法能够在有限的实验次数下,对影响生物过程的因子进行优化及对其交互作用进行评价,蛋白表达量达20.4 mg/L;IPTG用量由原来的1 mmol/L减少至现在的0.1 mmol/L,降低了发酵成本。; 周孙林陈华新姜鹏李富超唐东山; 关键词：响应面法

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国家自然科学基金(41276164)