国家自然科学基金(81200032)
- 作品数：3 被引量：6H指数：1
- 相关作者：庞敏杜永成王海龙陈丽丽张振霞更多>>
- 相关机构：山西医科大学第一医院山西医科大学山西省人民医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金山西省卫生厅科技攻关计划项目年山西省研究生优秀创新项目更多>>
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- 大鼠Clara细胞分泌蛋白CC16基因的克隆和原核表达及纯化被引量：1
- 2013年
- 目的克隆大鼠Clara细胞分泌蛋白(CC16)基因,原核表达并纯化重组的CC16蛋白,为进一步研究CC16蛋白的功能及对炎症性气道疾病的治疗作用奠定基础。方法制备大鼠肺组织总RNA,根据大鼠CC16基因全长编码序列(GenBank登录号:NM_013051)的开放阅读框设计引物并进行逆转录PCR(RT-PCR)扩增,扩增产物经双酶切后连接入pET30a(+)载体,重组质粒转化大肠埃希菌(E.coli DH5α),阳性菌落经PCR和双酶切鉴定并测序。将重组质粒pET30a(+)-rCC16转化至E.coli Rosetta(DE3)并加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结合考马斯亮蓝染色检测表达产物,重组融合蛋白经Ni2+琼脂糖凝胶亲和纯化。分别以抗His标签抗体和山羊抗CC16抗体进行免疫印迹(Western blotting)分析并鉴定重组蛋白。结果 RT-PCR扩增产物约为290 bp。菌落PCR、双酶切及测序结果显示,重组质粒pET30a(+)-rCC16构建成功。SDS-PAGE结果显示,经IPTG诱导获得相对分子质量约16 kDa的可溶性重组蛋白。Western blotting结果表明,诱导表达的蛋白质为带His标签的重组融合蛋白,且能被山羊抗CC16抗体识别。结论成功构建基因重组体pET30a(+)-rCC16,并制备出可溶性大鼠重组CC16蛋白。
- 庞敏杜永成蒋毅刘志宏张彩苹陈丽丽王海龙
- 关键词：原核表达免疫印迹
- CC16蛋白质与肺部疾病被引量：4
- 2014年
- CC16蛋白质是由细支气管、终末细支气管黏膜上的无纤毛柱状上皮细胞——clara细胞分泌产生。CC16为组织特异性蛋白，主要表达在肺组织，它是一种肺的内源性抗炎因子。其抗炎作用可能非常复杂，机制之一是抑制磷脂酶A2的活性。由于其在肺部高表达，CC16与许多肺部疾病的发生发展有关，例如支气管哮喘、COPD、间质性肺疾病、肺癌、ALI等。
- 庞敏杜永成
- 关键词：CC16肺部疾病
- 小鼠无纤毛柱状上皮细胞分泌蛋白基因真核表达载体的构建及其生物活性的鉴定被引量：1
- 2015年
- 目的克隆小鼠无纤毛柱状上皮细胞分泌蛋白(CCSP)基因并构建其真核表达重组体,鉴定重组CCSP的生物学活性。方法采用TRIzol法提取小鼠肺组织总RNA,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)对CCSP基因进行扩增,Bam H I和XhoⅠ双酶切扩增产物与真核表达载体p CDNA3.1(+),酶切产物连接并转化入感受态细胞Trans 5α,阳性重组质粒p CDNA3.1(+)-m CCSP经PCR、酶切和测序鉴定正确后,通过DNAfectin 2100 DNA转染试剂将重组质粒转染人胚肾(HEK293T)细胞,采用Western blot法检测表达产物。脂多糖分别刺激转染有p CDNA3.1(+)-m CCSP和p CDNA3.1(+)质粒DNA的HEK 293T细胞,利用磷脂酶A2的水解作用,以掺入大肠杆菌膜的[3H]标记的油酸为酶解底物,检测HEK 293T细胞内PLA2的活力。结果聚合酶链反应结果显示,从小鼠肺组织中扩增出约290 bp的片段。菌落PCR、双酶切及测序结果显示,重组质粒p CDNA3.1(+)-m CCSP构建成功且序列正确。Western blot结果显示,在转染p CDNA3.1(+)-m CCSP的HEK293T细胞中有CCSP蛋白的表达,蛋白质分子量约为10 k Da,而转染空质粒组未见表达。CCSP蛋白可以显著降低脂多糖诱导的HEK 293T细胞内PLA2的活力。结论成功构建了真核表达重组体p CDNA3.1(+)-m CCSP,且重组蛋白CCSP具有生物学活性,为进一步研究其功能奠定了基础。
- 庞敏袁丽荣张振霞李冬艳王海龙
- 关键词：真核表达脂多糖磷脂酶A2
