黑龙江省科技攻关计划(GA06B202)
- 作品数：13 被引量：118H指数：5
- 相关作者：于力周国辉马文戈王海伟李爽更多>>
- 相关机构：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所东北农业大学哈尔滨师范大学更多>>
- 发文基金：黑龙江省科技攻关计划国家科技支撑计划国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 牛荚膜血清A型巴氏杆菌病的分子流行病学调查被引量：18
- 2010年
- 本研究针对多杀性巴氏杆菌(Pm)特异性基因kmt1,进化保守基因16S rRNA基因,以及荚膜血清型A、B、D、E和F型对应的荚膜生物合成基因hayD-hayC、bcbD、dcbF、ecbJ和fcbD,设计特异性PCR扩增引物,采用PCR方法扩增相应基因和进行序列测定,并对分离菌株进行分子鉴定和同源性分析。结果显示,来自不同地区的分离菌株均含有Pm种特异性基因kmt1、A型荚膜生物合成基因hayD-hayC和16S rRNA基因。不同地区的分离株,kmt1基因的同源性为100%;A型荚膜生物合成基因hayD-hayC同源性大于99.9%;与国外牛源分离株的hayD-hayC基因的同源性大于98%;不同地区分离株的16S rRNA基因的同源性为100%,而与英国牛源分离株Pm338的16S rRNA基因的同源性高达99.93%。这些结果表明,在我国6个省市流行的牛出血性败血症由同一来源的荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌所致,与英国牛源A型分离株Pm338具有共同的进化来源。
- 马文戈姜志刚于力
- 关键词：RRNA进化分析
- 表达牛冠状病毒S1基因的重组人腺病毒的构建及鉴定被引量：5
- 2010年
- 为构建表达牛冠状病毒(BCV)S1基因的重组人腺病毒疫苗,本实验通过人工合成密码子优化的截短BCV S1的基因片段(55 bp～1 650 bp)。将其克隆到重组腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV中,并以PmeⅠ线性化后转化含有人5型腺病毒骨架的BJ5183感受态细胞,通过细菌内同源重组的方式获得重组腺病毒质粒pAdV-BCV-S1,经PacⅠ线性化后转染AD-293细胞获得重组腺病毒rAdV-BCV-S1。利用间接免疫荧光法和western blot法检测该重组腺病毒的S1基因在AD-293细胞中的表达情况,同时用一步生长曲线法,测定该重组腺病毒的复制能力。结果表明:BCV S1基因在感染细胞中获得了高效表达:子代重组腺病毒在感染细胞后60 h滴度最高,为6.8×108 pfu/mL。该重组腺病毒的构建为BCV重组疫苗的研究奠定了基础。
- 周国辉于力魏萍
- 关键词：牛冠状病毒S1基因重组腺病毒
- Asia1型和O型口蹄疫病毒中和性单克隆抗体的免疫保护性被引量：1
- 2009年
- 本研究用微量中和试验鉴定具有中和活性的口蹄疫病毒(FMDV)单克隆抗体,进而用乳鼠保护试验在体内验证单克隆抗体对FMDV感染的免疫保护作用。结果表明,针对Asia1型和O型FMDV的单克隆抗体3E11和8E8腹水的半数保护量(PD50)分别为1995和2371;仅用8PD50单抗3E11和11PD50单抗8E8,就可完全保护乳鼠耐受致死剂量Asia1型和O型FMDV的攻击。被动免疫的乳鼠在攻毒后体重增长的百分率随单抗腹水浓度的升高而增加,而且随着单抗腹水浓度的升高,乳鼠的起始死亡时刻后延、终点死亡时刻前移。
- 周国辉于力
- 关键词：口蹄疫病毒中和性单克隆抗体保护性免疫
- O型泛亚谱系口蹄疫病毒cDNA感染性克隆的建立被引量：10
- 2009年
- 本研究采用RT-PCR技术将O型口蹄疫病毒(FMDV)O/YS/CHA/05株全长基因组分4个cDNA片段进行克隆、拼接,构建了具有感染性的FMDV cDNA克隆pOKT7-O/YS/CHA/05。将线性化的pOKT7-O/YS/CHA/05在细胞外转录获得的病毒RNA转染BHK-21细胞,经培养可见典型的细胞病变(CPE)。同时,将线性化的pOKT7-O/YS/CHA/05与含有编码T7 RNA聚合酶的真核表达重组质粒共转染BHK-21细胞,同样也观察到典型的CPE。对拯救的病毒进行RT-PCR扩增、酶切和序列分析鉴定表明,拯救病毒含有不同于亲本病毒的分子标记,即在病毒核酸的3510位人工消除了XbaⅠ酶切位点。免疫电镜观察和间接免疫荧光试验进一步表明,拯救出了FMDV。病毒生长比较试验表明,拯救病毒与亲本病毒具有相似的增殖特性。本研究构建了O型口蹄疫病毒的感染性克隆并获得了拯救病毒,为深入研究FMDV的致病机理以及开发新型疫苗提供了有效的反向遗传操作平台。
- 杨德成涂亚斌王海伟周国辉于力
- 关键词：口蹄疫病毒全长CDNA病毒拯救
- 噬菌体展示技术与病毒抗原表位研究被引量：3
- 2009年
- 噬菌体展示技术（Phage display technology）始创于1985年，Smith首次将外源基因插入丝状噬菌体f1的基因，使目的基因编码的多肽以融合蛋白的形式展示在噬菌体表面，从而创建了该技术。1988年Parmley等将已知抗原决定簇与PⅢ的N端融合呈现在噬菌体表面，可特异性地被抗体选中，因此提出了通过构建随机肽库了解抗体识别的抗原表位的设想。
- 于永忠李集临徐香玲于力
- 关键词：噬菌体展示技术病毒基因插入丝状噬菌体SMITH抗原决定簇
- O型口蹄疫病毒单克隆抗体的制备及生物学特性分析被引量：1
- 2009年
- 以纯化的O型口蹄疫泛亚毒株O／YS／CHA／05抗原免疫BALB／c小鼠，在加强免疫3d后，取脾细胞与SP2／0骨髓瘤细胞进行融合，经间接ELISA法和间接免疫荧光法（IFA）筛选，获得2株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为4A8和1F6，同时确定二者均为O型口蹄疫病毒特异性单克隆抗体。中和试验和Western—blot分析结果表明，4A8和1F6均识别线性表位，无中和活性。亚类鉴定结果显示：4A8和1F6重链类型分别为IgG1和IgG2b；轻链类型均为κ。相加ELISA分析结果表明，两者针对的抗原位点相同或相近。
- 于永忠赵磊周国辉徐香玲于力
- 关键词：口蹄疫病毒单克隆抗体
- 牛源A型多杀性巴氏杆菌培养特性和免疫原性的研究被引量：18
- 2010年
- 为了确定牛源荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌(Pm)的培养特性,本研究采用脑心浸液(BHI)培养基分别于静止、75r/min、250r/min3种培养转速对Pm进行培养,并与加血BHI进行比较,通过绘制生长曲线和小鼠毒力试验对Pm的培养基和培养转速条件进行优化,确定最佳培养条件为,以37℃,0.1%全血脑心浸汤(MB-HI)培养基,75r/min培养16h。将培养的A型Pm灭活后,免疫SPF小鼠,同时设立B型Pm灭活苗免疫组,攻A型Pm后的结果显示,A型灭活菌的保护率为100%,而B型灭活苗免疫组全部死亡。本研究通过对牛源A型Pm培养特性和免疫原性的研究,为新型牛出血性败血症灭活疫苗的研制提供了实验依据。
- 姜志刚马文戈于力
- 关键词：多杀性巴氏杆菌
- 口蹄疫病毒非结构蛋白3AB单克隆抗体的制备及其对应表位区分析被引量：1
- 2011年
- 为鉴定口蹄疫病毒(FMDV)的非结构蛋白3AB的抗原表位,本研究以原核表达并纯化的FMDV 3AB重组蛋白免疫BALB/c小鼠,采用淋巴细胞杂交瘤技术制备杂交瘤细胞,通过间接ELISA进行筛选,获得6株能够稳定分泌抗3AB蛋白特异性单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞。这6株MAbs亚类鉴定均为IgG1型,轻链均为κ链。间接免疫荧光试验结果表明,这6株MAbs均能够识别FMDV 3AB蛋白。采用制备的MAb对分段表达的3AB蛋白进行western blot分析,结合位点分别位于3AB的第aa 55～aa 70、aa 64～aa 79、aa 130～aa 145区段。该结果为进一步探索3AB蛋白的结构和功能以及建立诊断方法奠定了基础。
- 刘丹丹高明春宋军宋鸽曹永生张润祥李爽于力王君伟
- 关键词：口蹄疫病毒单克隆抗体
- 牛口蹄疫病毒VP2结构蛋白抗体间接ELISA方法的建立被引量：5
- 2010年
- 为建立牛口蹄疫(FMD)抗体的检测方法,本研究将口蹄疫病毒(FMDV)的VP2基因,通过pPROEXTM HTb表达载体在大肠杆菌DH5α中表达,获得大小为35ku的重组VP2蛋白(rVP2),western blot证实rVP2可与FMDV5种血清型的牛阳性血清发生特异性反应。以纯化复性的rVP2为抗原建立了FMDVrVP2间接ELISA方法。重复性试验证实批内、批间变异系数均小于10%。特异性交叉试验表明,该抗原不与常见的其他7种牛病阳性血清发生交叉反应。检测非免疫无口蹄疫国家牛阴性血清的特异性为100%;检测感染血清敏感性为97.3%;检测O-AsiaⅠ的二价苗免疫牛血清,与4种商品化试剂盒比较,其符合率分别为69.0%、95.0%、90.4%和86.8%。实验结果表明建立的ELISA方法可以用于口蹄疫感染和免疫抗体检测。
- 张润祥高明春曲哲会李爽曹永生宋军宋鸽刘丹丹王君伟
- 关键词：口蹄疫病毒VP2蛋白间接ELISA
- 牛Asia 1型口蹄疫病毒感染性克隆的构建被引量：2
- 2009年
- 本研究在完成Asia1型口蹄疫病毒(FMDV)As01株全基因组测序的基础上,采用融合PCR扩增得到含有15个C碱基的5′端片段(约1800bp),并利用长片段PCR扩增得到基因组3′端片段(约6700bp)。再利用单一的酶切位点将2个片段克隆到pBluescript SK载体中,从而获得携带As01株基因组全长cDNA的重组质粒pBSAs。将该质粒线性化后作为模板体外转录并转染BHK-21细胞,可观察到典型的细胞病变。对收获的病毒采用RT-PCR、间接免疫荧光和电镜观察等检测及鉴定,结果表明,拯救出了具有感染性的Asia1型FMDV。拯救毒与亲本毒对乳鼠的致病力(LD50)差异不显著,具有相似的生物学特征。该感染性克隆的构建,为深入研究FMDV的致病机理及开发新型疫苗提供了有效的反向遗传操作平台。
- 李爽张润祥宋鸽高明春刘湘涛王君伟
- 关键词：口蹄疫病毒全长CDNA感染性克隆病毒拯救体外转录
