国家自然科学基金(30670734)
- 作品数：13 被引量：68H指数：5
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- 流式细胞仪碘化丙啶染色法测定类胰岛素生长因子Ⅰ对人胚胎原代及传代成肌细胞生长周期的作用被引量：1
- 2008年
- 目的：大量研究表明,类胰岛素生长因子Ⅰ促成肌细胞增殖作用明显,低浓度水平就有活性,但是对于其作用机制目前还不太清楚。应用流式细胞仪碘化丙啶染色法（PⅠ法）检测成肌细胞生长周期,拟探讨类胰岛素生长因子Ⅰ对原代及传代人胚骨骼肌成肌细胞体外增殖的作用与机制。方法：实验于2004-06/12在四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室、干细胞与组织工程研究室以及成都市第三人民医院检验科流式细胞室完成。在产妇知情同意的前提下,选取孕8-12周水囊引产胎儿,性别不限,切取部分小腿腓肠肌与股四头肌组织后,采用文献的方法进行成肌细胞分离、纯化与传代培养,实验经医院伦理委员会批准。选取原代、第2、4、6代成肌细胞以1×105/孔密度接种于24孔板,每3孔为1组计7组。1-7组细胞以无血清F12培养基同步化后分别予以含0,1,2,4,8,16,32μg/L类胰岛素生长因子Ⅰ的培养基,运用核素掺入法确定类胰岛素生长因子Ⅰ促增殖的适宜浓度用于实验。同步化后其中一板的生长培养基不加类胰岛素生长因子Ⅰ作为对照组;另一个加入适宜浓度的类胰岛素生长因子Ⅰ作为实验组。每组每天取3孔细胞计数,绘制生长曲线,推算成肌细胞的群体倍增时间,作为细胞增殖周期TC。运用流式细胞技术PI法分别测定细胞生长周期和各亚周期时相时间。结果：4-8μg/L类胰岛素生长因子Ⅰ具有良好促进成肌细胞增殖的能力。各代的实验组与对照组成肌细胞在24h后进入对数生长期,各实验组细胞生长曲线明显左移。6代以内成肌细胞的增殖周期、各亚周期细胞百分比、各亚周期所占时相以及各代细胞对类胰岛素生长因子Ⅰ的反应一致,生长模式与能力一致,细胞倍增时间平均从4.8d缩短到3.3d。结论：类胰岛素生长因子Ⅰ能促进成肌细胞体外增殖,成肌细胞的增殖指数明显提高�
- 张峻梅岑石强杨志明解慧琪唐方
- 关键词：成肌细胞流式细胞术细胞移植
- 人成纤维细胞稳定转染的方法比较被引量：8
- 2008年
- 目的采用3种不同的方法将质粒pEGFP-N1转染人成纤维细胞,从中寻找最佳的稳定转染的方法。方法分别采用阳离子聚合物转染、阳离子脂质体转染和电转染方法,将能表达G418抗性蛋白和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的质粒pEGFP-N1转染人成纤维细胞。24h后,荧光显微镜下观察EGFP表达,流式细胞术测定瞬时转染率;通过G418筛选得到稳定转染的细胞。结果电转染有最高的瞬时转染效率(56.8%),稳定转染得到的阳性克隆最多,且从细胞筛选到扩增至得到阳性大克隆所用的时间也最少(约20d);用阳离子聚合物瞬时转染率低(1.7%),稳定筛选同样可以得到阳性大克隆,但是数量很少且从细胞筛选到扩增至阳性大克隆所用的时间也最多(约30d);阳离子脂质体转染效果居中,瞬时转染率为39.9%,从细胞筛选到扩增至得到阳性大克隆所用的时间约25d。结论用电转染法将质粒pEGFP-N1转染人成纤维细胞是最佳的转染方法。
- 芦小燕解慧琪李莉智伟陈晓禾邓力
- 关键词：人成纤维细胞稳定转染电转染
- IGF-1促原代人胚骨骼肌成肌细胞体外增殖与分化的研究被引量：9
- 2008年
- 目的为更好地将成肌细胞应用于组织工程构建,探讨IGF-1对原代人胚骨骼肌成肌细胞体外增殖与分化的作用与机制。方法通过核素3H-TdR掺入法测定不同浓度IGF-1(1、2、4、8、16和32ng/mL)作用下成肌细胞的每分钟射线脉冲数(count per minute,CPM)值,根据浓度-CPM值量效曲线确定IGF-1促增殖的适宜浓度。在生长培养基中加入该浓度的IGF-1用于实验组细胞,对照组细胞仅接受生长培养基。分别观察实验组与对照组生长曲线,比较两组细胞增殖周期的变化。运用流式细胞技术及核素掺入法测定适宜浓度IGF-1作用下,成肌细胞增殖周期的变化。另选取不同浓度IGF-1(0、5、10、15、20、25、30ng/mL)作用于成肌细胞,观察4d后成肌细胞融合率,通过融合率-IGF-1浓度-量效曲线确定IGF-1促进成肌细胞融合的最佳浓度,并将其用于实验组,而未接受该浓度IGF-1的成肌细胞作为对照组,分别测定两组细胞融合率与磷酸肌酸激酶(creatine kinase,CK)含量并进行比较。结果5ng/mL的IGF-1为促成肌细胞增殖最佳浓度。对照组成肌细胞倍增时间为96h;实验组成肌细胞生长曲线左移,倍增时间缩短为60h。对照组DNA G1、S期与G2M期各亚周期所占时间分别是70.03、25.01与0.96h,实验组为22.66、16.47与20.87h。实验组与对照组成肌细胞CPM峰值出现的时间分别是48h与96h,与生长曲线流式细胞技术测定结果一致。IGF-1促进分化研究显示20ng/mL IGF-1为促成肌细胞分化最佳浓度。实验组成肌细胞融合率较对照组提高30%,CK合成量提高2000mU/mL。结论IGF-1对成肌细胞的增殖与分化均具有促进作用,是通过减少G1期成肌细胞数量,增加S期与G2M期细胞实现的。20ng/mL IGF-1能明显增加成肌细胞融合率CK合成。
- 岑石强张峻梅黄富国杨志明解慧琪
- 关键词：IGF-1流式细胞术体外培养
- 胎盘间充质干细胞与骨髓间充质干细胞分离培养和生物学特性研究被引量：13
- 2007年
- 目的探讨兔胎盘问充质干细胞（placenta—derived mesenchymal stem cells，PMSCs）和兔骨髓间充质干细胞（bone marrow—derived MSCs，BMSCs）体外分离培养、增殖，对其生物学性状进行比较观察。方法取足月待产新西兰大耳白兔1只，采用密度梯度离心法及贴壁培养技术从兔胎盘对PMSCs进行分离、纯化和传代培养。取2周龄新西兰大耳白兔1只，采用直接贴壁法从后肢骨髓中对BMSCs进行分离、纯化和传代培养。用倒置相差显微镜观察两种细胞形态。免疫组织化学染色对第3代细胞表面标志（CD44、CD105、CD34、CD40L）进行鉴定。将BMSCs与PMSCs第2代细胞分别与生物衍生骨进行复合培养5d，每条材料接种（1．0～1．5）×10^6个细胞，苏木素染色观察细胞与材料复合培养情况。扫描电镜观察两种细胞分别与材料复合培养3d和8d的情况。结果在倒置相差显微镜下观察，两种细胞均为贴壁生长，形态为均一成纤维细胞样。PMSCs增殖力强，细胞的增殖能力随传代次数的增加而有所下降，细胞体外培养10代后，生长速度减慢。两种细胞均表达CD44、CD105，不表达CD34、CD40L。复合培养5d，PMSCs和BMSCs在生物衍生骨表面生长，大量黏附，细胞积聚成团，相互连接成网状，孔隙内也可见细胞生长和增殖，并分泌基质。扫描电镜观察：复合培养3d，可见较多量的细胞在生物衍生骨上黏附，呈梭形或多角形；8d两种细胞均已大量增长，呈层状排列，细胞连接紧密，分泌大量基质，细胞周围有较多的网状胶原形成。结论PMSCs与BMSCs有相似的生物学特性，可作为组织工程的另一成体干细胞来源。
- 卢遥邓力李秀群智伟杨志明解慧琪
- 关键词：胎盘间充质干细胞骨髓间充质干细胞生物学特性
- 口腔黏膜上皮细胞与猪小肠黏膜下层体外复合培养的实验研究被引量：8
- 2010年
- 目的探讨体外快速培养犬口腔黏膜上皮细胞(OMECs)及其与猪小肠黏膜下层(SIS)体外复合培养的方法,为组织工程化黏膜研究提供实验依据。方法采用混合酶消化法,于6%胎牛血清的上皮细胞无血清培养基(DKSFM)中培养OMECs,观察OMECs的形态特征、绘制生长曲线并进行细胞表面标志物检测。将第2代犬OMECs接种在SIS上,行苏木精-伊红染色、免疫组织化学染色、扫描电镜等观察OMECs在SIS上的生长状况。结果OMECs在DKSFM中生长良好,CK19细胞角蛋白免疫组化染色阳性。OMECs接种在SIS上呈单层生长,多角形,铺路石样排列,复合培养8d呈多层生长。结论采用混合酶消化法,用含6%胎牛血清的DKSFM培养犬OMECs,方法简便,适合推广应用。SIS与OMECs有良好的相容性,可作为构建组织工程化黏膜的理想支架材料。
- 谭波魏人前杨志明李秀群韩平智伟解慧琪任燕谭中侠
- 关键词：口腔黏膜上皮细胞小肠黏膜
- 上皮细胞条件培养液对BMSCs分化的影响被引量：3
- 2009年
- 目的探讨上皮细胞条件培养液(epithelial cell conditioned medium,ECCM)体外诱导犬BMSCs向上皮细胞分化的可行性。方法成年健康雄性比格犬1只,体重10kg。于犬髂后上棘采用骨髓穿刺法取骨髓5mL,分离培养BMSCs。取犬口腔黏膜下组织,剪成约4mm×4mm大小,制备ECCM。取第2代BMSCs以2×104个/孔细胞密度接种,实验组于ECCM中培养,对照组于低糖DMEM完全培养基中培养。观察两组细胞形态特征,MTT法绘制生长曲线,诱导培养21d免疫组织化学染色鉴定上皮细胞特异性标志物——细胞角蛋白19(cytokeratin19,CK-19)和细胞角蛋白AE1/AE3,透射电镜观察细胞超微结构。结果倒置相差显微镜下见两组细胞均呈长梭形,均匀分布,折光性较强,增殖迅速。两组细胞生长曲线均呈"S"形,实验组生长曲线较对照组右移,提示ECCM对细胞增殖有抑制作用。实验组CK-19和细胞角蛋白AE1/AE3免疫组织化学染色均呈阳性反应,对照组呈阴性。透射电镜下实验组细胞胞浆内可见紧密连接。结论ECCM体外有诱导同种BMSCs向上皮细胞分化的作用。
- 杨朋魏人前谭波李秀群王佳周昆鹏左潇李顺解慧琪
- 关键词：BMSCS上皮细胞诱导分化
- Development of Therapy for Duchenne Muscular Dystrophy被引量：2
- 2007年
- ZHANG SuzhenXIE HuiqiZHOU GuangqianYANG Zhiming
- 杜兴肌营养不良症治疗进展及前景被引量：1
- 2007年
- 目的综述杜兴肌营养不良症（Duchenne muscular dystrophy，DMD）治疗的最新研究进展。方法广泛查阅近年来相关文献，对DMD治疗的研究进展进行综述。结果目前对DMD的治疗主要有基因治疗、细胞治疗和药理学治疗，基因治疗和细胞治疗通过传递正常基因或修正突变基因以及移植正常细胞，如干细胞来进行治疗；而药理学治疗主要针对dystrophin基因缺陷引起的下游事件，运用各种药物来减缓DMD病理进程，从而改善患者的生活质量，延长寿命。结论针对DMD的各种治疗手段均存在一定困难，目前尚不能有效治疗此病。
- 张素珍解慧琪周光前杨志明
- 关键词：DYSTROPHIN基因肌营养不良基因治疗细胞治疗
- 兔胎盘来源间充质干细胞修复兔桡骨骨缺损的实验研究被引量：3
- 2011年
- 目的探讨兔胎盘来源间充质干细胞（PMSCs）构建的组织工程化骨修复兔桡骨节段性骨缺损的能力。方法取24只大耳白兔，于兔双侧桡骨中下段制造1．5cm的节段性骨缺损，左侧骨缺损用PMSCs构建的组织工程化骨桥接（实验组），右侧用骨髓基质干细胞（BMSCs）构建的组织工程化骨桥接（对照组）。实验动物双侧于术后2、4、8、12周摄X线片和取材，对双侧X线片进行影像学评分；对取材行大体、组织学检查、生物力学性能测定和扫描电镜观察。结果术后2、4、8、12周实验组与对照组X线评分平均分别为（3．72±0．24）和（3．49±0．29）分、（6．24±0．41）和（5．91±0．45）分、（8．15±0．67）和（8．87±0．59）分、（11．39±0．86）和（12．04±0．93）分，两组比较差异均无统计学意义（P〉0．05）。组织学观察显示膜内化骨和软骨内化骨均参与了双侧骨缺损愈合的成骨过程，但以软骨内化骨为主。术后2、4、8、12周实验组与对照组最大载荷平均分别为（48．76±6．03）和（56．17±4．10）N、（65．64±4．49）和（74．67±7．69）N、（101．04±3．35）和（90．77±6．91）N、（131．35±6．91）和（150．61±21．41）N，两组比较差异均无统计学意义（P〉0．05）。结论两种细胞构建的组织工程化骨都可以较快地修复长骨临界大小节段性骨缺损，PMSCs与BMSCs具有相似的生物学特性和成骨特性，可作为骨组织工程的另一成体干细胞来源。
- 卢遥王静成顾加祥颜连启冯新民戴善和王强虞海流解慧琪李秀群杨志明
- 关键词：间质干细胞胎盘骨髓
- c-Met在骨骼肌损伤组织肌卫星细胞中的表达被引量：5
- 2009年
- 目的探讨肝细胞生长因子受体（c-Met）在正常和注射心脏毒素后，致肌损伤的肌肉组织中具有再生能力的肌卫星细胞的表达情况；为进一步研究某些肌肉变性疾病，如进行性肌营养不良（DMD）在发病中的分子机制和治疗肌肉退行性变提供参考依据。方法C57雄性小鼠12只，饲养于独立送排风笼具（IVC Cage）实验室。随机分为6组，1-6组左侧股四头肌局部注射心脏毒素（5μg／只），右侧股四头肌为对照，1-6组分别在注射后1d、4d、1周、2周、4周、6周颈椎脱臼处死小鼠，完整分离出股四头肌。浸入4％甲醛溶液中固定，常规包埋切片染色，与对照C57小鼠股四头肌进行组织学和免疫组织化反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）比较分析（样本量为10），了解c-Met的原位表达情况。结果免疫组织化学和反转录聚合酶链式反应结果显示，正常小鼠股四头肌中c-Met在肌卫星细胞上仅有少量的表达；与对照比较，注射心脏毒素24h后，表达即明显增加并持续到观察终点的第6周，且其表达量在第1周达到高峰且直到观察期间末（第6周），仍高于正常肌肉组织，其差异有统计学意义（P〈0.05）。结论c-Met可能是肌肉损伤修复过程的关键蛋白。
- 李小雷黄厚今杨志明周光前解慧琪邓力
- 关键词：肌卫星细胞肝细胞生长因子受体心脏毒素肌损伤
