国家高技术研究发展计划(2006AA02A223)
- 作品数：5 被引量：7H指数：1
- 相关作者：李德新梁米芳李川张硕张全福更多>>
- 相关机构：中国疾病预防控制中心中山大学温州医学院更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 登革工型病毒E蛋白在293T细胞中的分泌表达被引量：1
- 2009年
- 目的分泌表达登革I型病毒prM／E基因，为研究该蛋白的免疫学功能和特性奠定基础。方法用RT-PCR法获得登革I型病毒广州分离株全长prM／E基因，在prM基因前添加乙型脑炎病毒的信号肽或同时替换E基因羧基末端的20％为乙脑病毒E基因相应的部分，分别将其克隆入真核表达载体pcDNA5／FRT中，获得三种重组质粒D1prME-pc5，D1JsprME．pc5，D1JsprM80E20JE-pc5。用脂质体法分别将重组质粒DNA转入293T细胞，通过免疫荧光、Western印迹检测外源基因在真核细胞中的分泌表达。结果用免疫荧光法检测到分别转染了三种重组质粒的293T细胞的胞质中均有登革I型病毒蛋白的表达。Western印迹检测转染了D1prME-pc5重组质粒的293T细胞上清中没有特异蛋白条带，转染了经基因改造的重组质粒D1JsprME-pc5和D1JsprM80E20JE-pc5的细胞上清中均存在登革I型病毒的特异蛋白条带。结论转染了三种重组质粒的293T细胞均可表达登革I型病毒prM／E蛋白，只有在prM基因前添加了信号肽的重组质粒转染后蛋白才获得分泌表达。
- 苗芳李川张硕王晓芳李建东张全福刘琴芝韦艳杭小同梁米芳李德新
- 关键词：登革热病毒基因
- 登革2型病毒ZS01／01株E蛋白在真核细胞中的分泌表达研究被引量：1
- 2011年
- 目的对登革2型病毒（DENV-2）ZSO1／01株E蛋白在哺乳动物细胞及昆虫细胞中的分泌表达进行研究。方法RT．PCR扩增DENV-2prM／E基因，通过融合PCR在prM基因前添加来自乙型脑炎病毒的信号肽序列，并将E基因羧基末端20％区域缺失或替换为乙型脑炎病毒SA14-2株E基因相应序列，将上述基因元件分别克隆人哺乳动物细胞表达载体pcDNA5／FRT及昆虫细胞表达载体pAcUW51-M中，将重组质粒转染293T细胞或Sf9细胞，利用间接免疫荧光（Immunofluoreseence assay，IFA）及Western Blot检测E蛋白的表达与分泌。结果各重组质粒分别转染293T细胞或Sit）细胞后，E蛋白在细胞内均有效表达，而仅有携带乙脑信号肽且缺失或替换E基因羧基末端20％区域的重组质粒转染293T细胞后，上清中可检测到明显的E蛋白分泌。结论信号肽及E基因羧基末端20％区域对登革病毒E蛋白的分泌至关重要，宿主细胞对其亦有一定影响。
- 张硕顾雯李川苗芳陆鹏曲靖韦艳张全福刘琴芝李建东梁米芳李德新
- 关键词：登革热病毒
- 登革3型病毒义乌流行株免疫原性研究被引量：1
- 2011年
- 目的对2009年浙江省义乌市暴发流行的登革3型病毒进行系统进化分析并初步研究其E蛋白的免疫原性。方法 RT-PCR扩增义乌分离株全基因组,利用MEGA 4分别构建E及NS1区域核苷酸及氨基酸系统发生树,进行系统进化分析。构建重组质粒JESS-ywD3prM/E397JEV-pcDNA5,IFA及Western Blot检测E蛋白在293T细胞中的表达及分泌情况。将纯化后的分泌性E蛋白免疫BALB/c小鼠,通过ELISA、中和试验等方法对体液免疫进行测定。结果登革3型病毒义乌分离株与广州GZ1D3株及印度GWL-25株核苷酸及氨基酸序列同源性均达到99%以上;其分泌性E蛋白可以刺激小鼠产生登革特异性IgG抗体及针对同型病毒的中和抗体。结论义乌分离株属于登革3型病毒亚型Ⅲ,其分泌性E蛋白具有一定的免疫原性。
- 顾雯金聪张硕张全福李建东杭小同王芹李川梁米芳李德新
- 关键词：登革3型病毒生物学特性
- 登革2型病毒包膜蛋白在毕赤酵母中的表达和病毒样颗粒的组装被引量：4
- 2011年
- 目的在组成型的毕赤酵母系统中表达登革2型病毒包膜蛋白E和前膜蛋白prM,并研究病毒样颗粒在酵母细胞中的组装特性。方法以登革2型病毒ZS01/01株mRNA为模板,扩增编码prM/E蛋白的基因。将目的基因克隆至表达载体pGAPZaA的多克隆位点,并转化毕赤酵母GS115。经Zeocin抗生素筛选和PCR鉴定后获得酵母菌重组克隆,并进行表达和鉴定。结果成功克隆登革2型病毒prM/E基因,SDS-PAGE和Western blot检测表明包膜蛋白E在组成型的毕赤酵母系统中得到高水平表达;利用透射电镜在重组酵母胞浆内检测到30-50 nm的登革2型的病毒样颗粒,并发现类似登革病毒感染的双层膜结构;免疫电镜结果证实重组病毒样颗粒可以与抗登革2型病毒血清反应,具有免疫反应性。结论成功的建立了组成型表达登革2型病毒样颗粒的毕赤酵母系统,为登革病毒样颗粒疫苗的制备奠定了基础。
- 刘文权江丽芳刘岩江汉宁汤云霞方丹云
- 关键词：登革病毒包膜蛋白毕赤酵母病毒样颗粒
- 登革3型病毒义乌流行株免疫原性研究(英文)被引量：1
- 2012年
- 目的对2009年浙江省义乌市暴发流行的登革3型病毒进行系统进化分析并初步研究其E蛋白的免疫原性。方法 RT-PCR扩增义乌分离株全基因组,利用MEGA 4分别构建E及NS1区域核苷酸及氨基酸系统发生树,进行系统进化分析。构建重组质粒JESS-ywD3prM/E397JEV-pcDNA5,IFA及Western Blot检测E蛋白在293T细胞中的表达及分泌情况。将纯化后的分泌性E蛋白免疫BALB/c小鼠,通过ELISA、中和试验等方法对体液免疫进行测定。结果登革3型病毒义乌分离株与广州GZ1D3株及印度GWL-25株核苷酸及氨基酸序列同源性均达到99%以上;其分泌性E蛋白可以刺激小鼠产生登革特异性IgG抗体及针对同型病毒的中和抗体。结论义乌分离株属于登革3型病毒亚型Ⅲ,其分泌性E蛋白具有一定的免疫原性。
- 顾雯金聪张硕张全福李建东杭小同王芹李川梁米芳李德新
- 关键词：登革3型病毒生物学特性
