云南省教育厅科学研究基金(2011C191)
- 作品数：4 被引量：9H指数：2
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- 相关机构：云南农业大学云南农业职业技术学院云南大学更多>>
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- 绿色荧光蛋白基因原核表达质粒pET32a-AcGFP1的构建及其在大肠杆菌中的高效表达被引量：2
- 2012年
- 为了构建绿色荧光蛋白AcGFP1基因的原核表达载体pET32a-AcGFP1,并诱导使其在大肠杆菌中高效表达,本研究以pIRES-AcGFP1质粒为模板,采用PCR技术特异性扩增绿色荧光蛋白AcGFP1基因,通过酶切和连接使其与原核表达载体pET32a(+)构成重组子,经PCR、酶切和测序鉴定后,重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3),用不同浓度的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达绿色荧光蛋白,经15%SDS-PAGE鉴定,结果显示:重组质粒pET32a-AcGFP1中的AcGFP1序列与Clontech公司的pIRES-AcGFP1质粒的AcGFP1序列完全一致,表明本实验已成功构建了含有绿色荧光蛋白基因AcGFP1的原核表达质粒。此外,pET32a-AcGFP1转化Rosetta(DE3),经不同浓度的IPTG诱导,SDS-PAGE检测均获得高效表达,为今后构建pET32a(+)-TAT-AcGFP1融合表达载体以及深入研究TAT的细胞膜穿透作用的机制奠定基础。
- 霍海龙赵跃王锐侯慧芳李卫真张永云刘丽仙王配霍金龙
- 关键词：绿色荧光蛋白基因克隆报告基因原核表达
- 版纳微型猪近交系白细胞介素6基因克隆、生物信息学及组织表达分析被引量：1
- 2015年
- 白细胞介素6(IL-6)是机体重要的免疫调节因子,在佐剂的应用方面具有很好的发展前景。本研究以版纳微型猪近交系(BMI)为实验动物,通过PCR法获得IL-6基因编码区序列,提交GenBank数据库,登录号为JQ839263。对BMI IL-6基因和相应的蛋白序列进行了生物信息学分析,结果显示该基因编码212个氨基酸,分子质量为23.88ku,等电点(pI)为6.66,存在一个保守结构域,一个跨膜结构,N端和C端均疏水,且在N端存在信号肽,有89%的可能性定位于细胞核。将BMI的IL-6基因编码区序列与NCBI下载到的4条猪IL-6基因序列进行比对,结果显示BMI IL-6与GenBank登录号为NM_214399和DQ832259的核苷酸序列完全相同,与GenBank登录号为AF309651和AF518322的核苷酸序列各存在1处碱基差异;多物种氨基酸序列比对及系统进化分析结果表明,BMI与骆驼亲缘关系最近。同时利用半定量PCR法确定了IL-6基因mRNA在BMI 12个组织中的表达量,结果发现在肺脏、皮肤、肌肉中表达量较高。本研究为进一步研究猪IL-6基因的表达调控奠定了理论基础。
- 王配陈园园霍金龙霍海龙王淑燕潘伟荣成文敏查星琴曾养志
- 关键词：白细胞介素6免疫调节基因克隆
- 猪α干扰素基因克隆、进化及表达特性分析被引量：4
- 2015年
- 为深入研究α干扰素在猪体内的调节和功能,本研究以猪为实验动物,通过RT-PCR扩增得到α干扰素基因全长编码区序列,提交Gen Bank数据库,获得登录号为"JQ839262"。生物信息学分析显示,该基因编码189个氨基酸,预测蛋白分子量为21.32 ku,等电点为6.37。蛋白质结构分析得出,IFN-α存在1个保守域,无跨膜结构,存在信号肽。疏水性分析显示其N端疏水,C端亲水。亚细胞定位显示,该蛋白分泌到细胞周质的概率为92.2%。系统进化分析表明,猪与牛、山羊的亲缘关系较近。同时通过荧光定量PCR法检测了α干扰素基因mRNA在猪13个组织中的表达量,发现在皮肤、肺、肌肉、心、脾中表达量较高。本研究为进一步研究猪α干扰素基因的表达调控奠定研究基础。
- 霍海龙陈园园王配刘丽仙王淑燕张永云王锐钱林东霍金龙
- 关键词：荧光定量PCR
- 猪白细胞介素6和α干扰素基因的融合及其原核表达被引量：2
- 2013年
- 为了获得猪白细胞介素6(IL6)和α干扰素(IFNα)双重活性的融合蛋白,研究其作为免疫佐剂的可行性,利用IL6和IFNα基因的编码区序列以及原核表达载体pET32a序列,设计了带有限制性内切酶位点、Linker序列以及His标签的特异性引物扩增出猪IL6和IFNα的成熟肽基因序列,并分别与克隆载体pMD18连接后转化Esche-richia coli DH5α,提取质粒酶切并连接构建重组质粒pMD18-IL6-IFNα。将该重组质粒和表达载体pET32a同时酶切并连接构建pET32-IL6-IFNα重组质粒,依次转化E.coli DH5α和E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞,并经不同终浓度的IPTG以及不同时间的诱导表达。结果成功构建了IL6和IFNα的融合表达载体,SDS-PAGE检测pET32-IL6-IFNα融合蛋白在E.coli Rosetta(DE3)中得到了较高表达,且经1.00 mmol/L IPTG诱导7.0 h后表达量最大,目的蛋白的相对分子量为44 960,与理论预期值一致。SDS-PAGE检测显示融合蛋白主要以不溶性的包涵体形式存在。
- 霍海龙赵跃王锐李卫真张永云刘丽仙王配苗永旺钱林东字荣英霍金龙
- 关键词：白细胞介素6Α干扰素基因融合原核表达
