“十五”国家科技攻关计划(2004BA713B04-06)
- 作品数：9 被引量：73H指数：5
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- 具有转糖基活性的糖苷酶的分子进化被引量：4
- 2007年
- 糖苷酶是糖类合成的重要催化剂,但其催化的反应为可逆反应,产物产量不高。近年来,通过糖苷酶催化位点氨基酸突变、其他位点氨基酸突变、随机突变、C端缺失突变和DNA混编(DNA shuffling)等方法对糖苷酶进行分子进化,使得糖苷酶合成糖类的产量大幅度提高,同时也优化了糖苷酶催化糖类合成时的其他性质,如区域选择性和温度耐受性等。
- 卢丽丽肖敏赵晗
- 关键词：糖苷酶分子进化
- 氟代糖在糖苷酶研究中的应用被引量：4
- 2006年
- 近年来，氟代糖应用于糖苷酶反应研究，显示出越来越重要的作用。氟代糖可以作为糖苷酶及其突变酶的水解底物研究酶学性质；氟代糖抑制剂可以标记糖苷酶催化中心，鉴定亲核体氨基酸。尤为重要的是，氟代糖可作为糖苷酶的糖基供体来合成糖类。糖苷酶突变后，可生成糖苷合成酶和硫代糖苷合成酶，可以用与正常底物构型相反的氟代糖作为糖基供体高效合成糖类，收率一般为60％-90％，有的可达100％。糖苷酶及其突变酶以氟代糖为底物高效合成糖类的研究，必将促进生物学、糖生物学和纳米生物材料的发展。
- 卢丽丽肖敏赵晗王鹏钱新民
- 糖苷合成酶——一类新型的寡糖高效合成工具被引量：11
- 2006年
- 寡糖是哺乳动物细胞表面糖蛋白和糖脂以及微生物来源的生理活性物质的要素之一,其应用于医药的巨大潜能至今还没有得到充分体现,主要原因是合成足够于临床使用的寡糖非常困难.传统的化学法和酶法在大规模合成寡糖方面都有一定局限性.近年来,分子生物学技术大大推动了糖苷酶合成寡糖的研究,将糖苷酶催化中心亲核体氨基酸定点突变为非亲核体氨基酸,导致酶的原有水解活性丧失,只催化糖苷键合成反应,寡糖产量最高可达99%,人工产生了一类新酶——糖苷合成酶(glycosynthases),随后又产生了硫代糖苷酶(thioglycoligases)和硫代糖苷合成酶(thioglycosynthases).糖苷合成酶的高通量筛选可用双质粒系统和酵母三杂交系统进行,其活性的进一步改进可通过亲核体氨基酸位点不同氨基酸取代、其他位点氨基酸突变、反应条件优化等方法进行,其区域选择性的改变或增强可通过改变糖基受体分子达到.糖苷合成酶作为一种新型高效的生物催化剂,对寡糖的工业化合成有着重要意义,它的出现对糖生物学的发展必将起到巨大的推动作用.
- 卢丽丽肖敏赵晗王鹏钱新民
- 关键词：糖苷酶高通量筛选
- 转糖基β-半乳糖苷酶产生菌Enterobacter agglomerans B1:筛选鉴定、发酵产酶及其合成低聚半乳糖的研究被引量：16
- 2008年
- 从土壤中筛选获得一株具有转糖基活性的β-半乳糖苷酶产生菌,综合其形态学特征、生理生化特征及16SrDNA序列同源分析结果,将其鉴定为成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)B1。通过单因子试验和正交试验,对B1菌株产转糖基β-半乳糖苷酶的培养条件进行了优化。最佳培养基主要组份为:乳糖1%,酵母粉1%,蛋白胨0.5%;发酵条件为:初始pH7.5,发酵温度25℃,发酵时间26h。在该培养条件下产酶量为9.7U/mL。利用薄层层析技术研究了pH、温度、底物浓度和反应时间对该菌株全细胞以乳糖为底物生成低聚半乳糖的影响,确定最适反应条件为:pH7.5缓冲液配制的30%乳糖溶液;50℃反应12h。最优化反应的转糖基产物经HPLC、TLC和MS分析,确定低聚半乳糖产量为40.7%,组分为转移二糖、三糖和四糖。
- 卢丽丽肖敏徐晓东
- 关键词：成团肠杆菌发酵条件低聚半乳糖
- 转糖基β-半乳糖苷酶生产含低聚半乳糖的低乳糖牛奶被引量：8
- 2007年
- 研究利用具有转糖基活性的β-半乳糖苷酶生产含低聚半乳糖的低乳糖牛奶。含低聚半乳糖的低乳糖牛奶既能解决乳糖不耐症问题,同时还在牛奶中增添了低聚半乳糖双歧因子。从Enterobacter sp．B5的无细胞抽提液中,利用硫酸铵沉淀制备具有转糖基活性的β-半乳糖苷酶,作用鲜牛奶生成含低聚半乳糖的低乳糖牛奶。利用薄层层析、高压液相色谱技术和软件NIH ImageJ 1．36分析了反应产物中的糖组分(葡萄糖、半乳糖、乳糖和低聚糖(包括转移二糖和三糖))。结果显示酶作用后的鲜牛奶中大约70%的乳糖转化为葡萄糖和半乳糖,至少10%的乳糖通过转糖基反应生成低聚半乳糖。在酶浓度为3U/ml,50℃酶解4h的反应条件下,获得含低聚半乳糖的低乳糖牛奶的糖组成为0．59%低聚半乳糖(含0．37%转移二糖和0．22%三糖),1．33%乳糖,2．83%单糖。本研究利用软件NIH ImageJ 1．36定量分析样品糖组分的TLC结果,可以避免乳糖的同分异构体-转移二糖在高压液相色谱结果中因无法分离而造成的漏检。
- 李正义肖敏卢丽丽李玉梅
- 关键词：Β-半乳糖苷酶低聚半乳糖低乳糖牛奶
- 微生物糖苷酶的新型突变酶——硫代糖苷酶的产生及应用
- 2007年
- 微生物糖苷酶的酸碱功能氨基酸突变酶能催化硫代糖苷的合成,这类酶被称为硫代糖苷酶。目前发展的硫代糖苷酶有β-硫代葡糖苷酶、β-硫代甘露糖苷酶、β-硫代半乳糖苷酶、α-硫代木糖苷酶和α-硫代葡糖苷酶,来源于细菌和古细菌,能合成多种硫代糖苷。最近,硫代糖苷酶被应用于糖蛋白的糖基化修饰,首次人工合成硫代糖蛋白。微生物糖苷酶合成功能的新延伸,对糖生物学、生物技术和制药业的发展将有着重要意义。
- 卢丽丽肖敏赵晗
- 关键词：糖苷酶
- 微生物酶法合成低聚半乳糖的新进展被引量：14
- 2008年
- 低聚半乳糖(GOS)是目前国际上已开发的功能性低聚糖之一,其商业化产品是应用微生物β-半乳糖苷酶以乳糖为原料进行转糖基反应获得,不同来源的酶合成GOS的结构不同,转糖基效率也存在差异。天然酶合成GOS的产量一般为20%～45%,分子改造获得的人工酶能将90%的乳糖底物转化为GOS;采用两相体系或反相胶束可以在一定程度上提高GOS产量。应用填充床反应器、活塞流反应器、膜反应器可规模化合成GOS;采用色谱柱法、酶法、纳滤膜法和微生物发酵法可纯化GOS产品,去除单糖及乳糖组分,扩大其应用范围。
- 卢丽丽李正义肖敏
- 关键词：低聚半乳糖Β-半乳糖苷酶
- Enterobacter cloacae B5产转糖基β-半乳糖苷酶发酵条件优化被引量：4
- 2008年
- β-半乳糖苷酶是一类非常重要的糖苷水解酶,已被广泛应用于食品工业降低乳制品中的乳糖含量.某些种类的β-半乳糖苷酶还具有转糖基活性,近年来被应用于合成低聚半乳糖和半乳糖苷化合物.通过单因子试验和正交试验,对肠杆菌Enterobacter cloacae B5产生转糖基β-半乳糖苷酶的培养基组成及发酵条件进行了优化.结果表明,以无机盐溶液I(CaCl20.011%、MnSO40.0001%、MgSO4.7H2O0.03%、KH2PO40.005%、FeSO4.7H2O0.003%)、乳糖1.5%、酵母粉2%、蛋白胨0.5%、起始pH8.5的培养基在25℃培养E.cloacaeB5菌株38h,产酶量达到最高值4.663UmL-1,大约是未优化时的3倍.通过优化产酶条件提高了全细胞酶源的酶活量,不仅为功能性低聚半乳糖的生产降低了成本,同时也为商业化β-半乳糖苷酶的大量提纯降低了成本.
- 卢丽丽肖敏徐晓东
- 关键词：ENTEROBACTERCLOACAEΒ-半乳糖苷酶发酵条件
- 转糖基β-半乳糖苷酶产生菌筛选和鉴定及酶催化生成低聚半乳糖被引量：20
- 2006年
- 通过水解活性和转糖基活性筛选,从实验室97株保存菌种中获得1株具有转糖基活性的β-半乳糖苷酶产生菌,克隆并序列分析了该菌株16S rDNA基因片断,GenBank收录号为DQ267829.综合其形态学特征、生理生化特征及16S rDNA序列同源性分析结果,将其鉴定为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)2-37-4-1.确定了该菌株β-半乳糖苷酶产酶培养基的碳源为乳糖1%,氮源为蛋白胨0.5%和酵母膏0.5%,培养条件为37℃摇床培养18 h;碳源实验证明,该菌株β-半乳糖苷酶产生为乳糖诱导型.利用薄层层析技术研究了pH值、乳糖底物浓度、反应温度和反应时间对该菌株β-半乳糖苷酶以乳糖为底物转糖基合成低聚半乳糖的影响,确定最适反应条件为pH7.5、50 mmol/L(磷酸缓冲液)配制的40%乳糖溶液,55℃反应24 h.转糖基反应产物高压液相色谱分析其组成为低聚半乳糖25.68%,双糖(包括乳糖和转移二糖)33.02%,葡萄糖26.37%和半乳糖14.92%.
- 王红妹肖敏李正义李玉梅钱新民
- 关键词：巨大芽孢杆菌RDNAΒ-半乳糖苷酶低聚半乳糖
