国家自然科学基金(20905058)
- 作品数：10 被引量：33H指数：3
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- 相关机构：天津科技大学河北北方学院教育部更多>>
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- 氧氟沙星噬菌体库的构建、筛选及抗体结构模拟
- 2014年
- 应用噬菌体展示和重组抗体技术制备抗氧氟沙星单链抗体(scFv)库,筛选获得氧氟沙星特异性噬菌体scFv以及同源模拟其三维结构。将从氧氟沙星杂交瘤细胞提取的总RNA,用RT-PCR反转录合成cDNA,以针对鼠源重链可变区(VH)及轻链可变区(VL)基因的兼并引物,扩增获得VH和VL可变区基因,通过SOE-PCR法将VH基因和VL基因通过柔性多肽Linker(Gly4Ser)3拼接成全长scFv基因片段,将双酶切后的scFv基因片段插入T7噬菌体,经体外包装后转化宿主菌BLT5403,成功构建库容量为3×105pfu/mL的抗体库,经4轮吸附-洗脱-扩增的富集,采用直接竞争ELISA筛选到4个特异性噬菌体scFv,运用Expasy软件模拟特异性scFv的三维结构。为进一步大量表达氧氟沙星单链抗体奠定了基础。
- 张秀媛何扩杜新军王俊平杨青
- 关键词：氧氟沙星单链抗体噬菌体展示酶联免疫分析
- 肉蛋类食品沙门氏菌分离与菌膜检测被引量：2
- 2010年
- 从天津市市内6区和塘沽区各农贸市场购买肉蛋类样品共计78份,利用国标方法从中分离沙门氏菌,根据种内特异性基因片段设计3对引物利用PCR方法对分离菌株进行鉴定,结果共鉴定沙门氏菌4株;利用结晶紫染色方法对4株沙门氏菌菌膜形成能力进行鉴定,其中2株菌膜形成能力较强。该试验结果能够有效反映天津市内肉蛋类食品卫生状况,并对沙门氏菌的控制提供有益参考。
- 王硕赵金龙刘昕煜朱超杜欣军
- 关键词：沙门氏菌PCR
- 食源性阪崎肠杆菌耐药性分析及超广谱β-内酰胺酶检测被引量：5
- 2011年
- 利用药敏纸片方法,对19株食品来源的阪崎肠杆菌进行16种常规抗生素药敏检测。结果显示,19株阪崎肠杆菌对苯唑西林以及头孢噻吩的耐药率分别为100%和78.95%,而均对其余种类抗生素敏感。采用PCR方法结合纸片扩散法对分离菌株进行分属于四大类β-内酰胺酶中的共10种超广谱β-内酰胺酶检测,结果未发现超广谱β-内酰胺酶阳性菌株。综合以上结果,目前食品中存在的阪崎肠杆菌仍为耐药性较弱的菌种,短时期内将不会对临床治疗带来较大威胁。
- 王硕朱超杜欣军刘昕煜
- 关键词：阪崎肠杆菌超广谱Β-内酰胺酶
- 草甘膦抗性基因的重组表达及ELISA检测方法的初步建立被引量：1
- 2010年
- 采用CTAB方法从转基因大豆中提取DNA,根据草甘膦抗性基因设计引物,利用PCR从大豆DNA中扩增获得特异性目的基因,将该基因片段连接至表达载体pET-30a(+)中,并转化感受态细胞BL21(DE3)进行诱导表达,对诱导剂浓度和诱导时间进行优化。利用纯化后的液体重组蛋白和SDS-PAGE切胶蛋白2种形式抗原免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并利用ELISA对抗体效价进行测定。研究结果表明,利用PCR从转基因大豆DNA中扩增出长度为1529bp的草甘膦抗性基因片段,经过重组表达获得分子量为55ku的重组蛋白,IPTG的最佳诱导浓度为0.1mmol/L,最佳诱导时间为4h,亲和纯化后其浓度为5.0mg/mL;经免疫,2种形式抗原获得的多抗效价分别达到1∶2400000和1∶800000。
- 王硕董峰杜欣军张伟伟吴懿娜
- 关键词：草甘膦多克隆抗体
- 基因工程抗体在食品安全检测中应用进展研究被引量：12
- 2014年
- 基因工程抗体是近年来发展起来的一种新型抗体,将其应用于食品安全检测是目前食品学科领域研究的热点之一。因基因工程抗体具有分子小、免疫原性低、可塑性强、成本低以及可大批量生产等诸多优点,所以在食品污染物检测方面具有潜在的巨大应用价值。本文综述了基因工程抗体的分类、对污染物的检测原理、展示技术以及目前基因工程抗体在食品污染物检测方面应用的一些最新进展和存在的不足之处。
- 何扩张秀媛杜欣军王俊平王硕
- 关键词：基因工程抗体噬菌体抗体库食品污染物SCFV
- 西维因单链抗体基因克隆、表达及活性分析被引量：2
- 2010年
- 利用兼并引物从西维因单克隆杂交瘤细胞的cDNA中克隆得到抗体基因的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH),长度分别为324bp和360bp,将其分别连接入pGEM-T-Easy载体进行测序;根据测序结果设计特异性引物和连接序列(Gly4Ser)3,利用重叠延伸PCR扩增得到长度为729bp的单链抗体基因片段(scFv),亚克隆至原核表达载体pET30a(+),并转化感受态细胞BL21(DE3)进行诱导表达;聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果显示,重组表达单链抗体形成包涵体,分子量大小约为33kDa,变性后利用不同条件进行复性,结果显示最佳复性时间为48h,最佳起始蛋白浓度为200μg/mL,含有精氨酸的复性液效果最佳;利用亲和层析纯化scFv,并利用竞争ELISA检测其活性,结果显示该scFv对西维因具有良好的亲和性和特异性。
- 王俊平张伟伟杜欣军吴懿娜董峰王硕
- 关键词：西维因单链抗体克隆活性
- 氧氟沙星单链抗体库的构建、筛选及蛋白结构模拟被引量：1
- 2014年
- 利用噬菌体展示技术构建兽药氧氟沙星单链抗体(scFv)库,从中筛选氧氟沙星特异性噬菌体scFv以及模拟其三维结构。将从氧氟沙星杂交瘤细胞提取的总RNA,用RT-PCR反转录合成第一链cDNA,设计以针对鼠源重链可变区(VH)及轻链可变区(VL)基因的兼并引物,通过PCR扩增获得VH和VL可变区基因,采用重叠延伸PCR技术将VH和VL拼接为全长scFv基因片段,将经内切酶EcoRⅠ和HindⅢ双酶切后的scFv基因片段插入到T7噬菌体中,经包装蛋白体外包装后转化宿主菌BLT5403,成功构建库容量为3×105pfu/mL氧氟沙星单链抗体库,经过4轮吸附-洗脱-扩增的富集后,采用直接竞争ELISA筛选得到4个特异性噬菌体scFv,经测序最后运用Expasy软件模拟特异性scFv的三维结构和物理化学性质。为进一步大量表达氧氟沙星单链抗体奠定了坚实的基础。
- 何扩张秀媛杜欣军王俊平杨青
- 关键词：氧氟沙星单链抗体噬菌体展示ELISA
- 噬菌体抗体库技术及其应用被引量：8
- 2010年
- 吴懿娜杜欣军张伟伟董峰王硕
- 关键词：噬菌体展示抗体库小分子物质
- 西维因抗体库的构建及特异性克隆的筛选被引量：1
- 2012年
- 在计算机辅助下,设计并合成西维因半抗原,与载体蛋白KLH连接后免疫Balb/C小鼠,经过5次免疫后,最高效价和特异性抑制率分别达到254 000和26%;提取免疫后小鼠脾脏总RNA,纯化mRNA后反转录获得cDNA,利用设计的兼并引物获得长度约为400 bp的轻链可变区和重链可变区基因片段,重叠延伸后获得长度约为780 bp的单链抗体基因。经过EcoR I和HindⅢ酶切后,连入T7噬菌体臂,构建西维因特异性的抗体库,抗体库原始滴度为1.74×107pfu。以西维因-OVA为配体对抗体库进行淘选,经过4轮淘选后,利用直接ELISA对获得噬菌体克隆进行特异性检测,西维因对克隆A4-7和A4-16的抑制率分别达到54.1%和66.4%。经过序列测定,2个克隆的轻链可变区分别由108和112个氨基酸构成,重链可变区分别由117和112个氨基酸构成。
- 王硕刘昕煜吴懿娜杜欣军朱超张洁
- 关键词：西维因噬菌体展示
- 西维因单链抗体同源建模及与西维因对接模拟研究被引量：1
- 2014年
- 抗体的结构决定其功能,由于目前没有西维因抗体结晶结构的解析导致其与抗原结合机理不清楚,严重影响ELISA检测技术中对抗体特异性能的改造。本研究应用分子模拟与对接技术预测西维因单链抗体的三维结构及其与西维因分子的结合模式,采用同源建模方法首先获得西维因单链抗体的三维结构,然后采用分子对接技术将三维结构模型与西维因分子进行对接。结果表明,结合过程中H-CDR2、H-CDR3和L-CDR2形成一个疏水型的凹槽,疏水型的凹槽助推西维因分子与之结合并将西维因分子牢固地卡在里面,可能的结合位点由Ala51、Ser52、Ile51、Gly54、Ser56、Arg98、Gly100等氨基酸残基组成。为深入认识西维因分子与其抗体相互作用机理提供了理论指导,并为下一步西维因单链抗体体外亲和力的成熟奠定基础。
- 何扩张秀媛杜欣军王俊平周晓楠
- 关键词：西维因同源建模分子对接
