广州市教育系统创新学术团队项目(13C06)
- 作品数：9 被引量：19H指数：3
- 相关作者：张雅洁王红艳李书华郑少秋谢晓斌更多>>
- 相关机构：广州医科大学梅州市人民医院更多>>
- 发文基金：广州市教育系统创新学术团队项目广州市科技计划项目国家教育部博士点基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 基因芯片筛选CD133^+/CD133^-肺腺癌细胞中新的耐药基因被引量：3
- 2014年
- 背景与目的肿瘤干细胞可能是肿瘤多药耐药的主要原因,CD133是目前较为公认的肿瘤干细胞标记物。本研究旨在应用功能分类基因芯片筛选CD133+和CD133-肺腺癌细胞中差异表达的肿瘤耐药基因,寻求新的肺癌耐药相关基因。方法免疫磁珠分选法分选A549细胞,采用功能分类基因芯片筛选CD133+和CD133-肺腺癌细胞中差异表达的肿瘤耐药基因,并使用RT-qPCR验证。顺铂半数有效抑制浓度(half inhibiting concentration,IC50)、阿霉素IC50作用A549细胞48 h后,RT-qPCR检测肿瘤耐药基因CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、GSK3α、PPARα和PPARβ/δ的表达变化。结果共筛查出31个差异表达的肿瘤耐药基因,与CD133-细胞相比,CD133+细胞有30个基因表达上调,1个基因表达下调。RT-qPCR结果与芯片一致。A549细胞经1.97μg/mL顺铂或0.61μg/mL阿霉素作用48 h后,CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、GSK3α、PPARα和PPARβ/δ等肿瘤耐药基因表达上调。结论利用功能分类基因芯片筛选出31个可能与CD133+肺腺癌细胞耐药相关的基因,其中CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、GSK3α、PPARα和PPARβ/δ为新发现的肺癌耐药相关基因。
- 王红艳郑少秋涂永生张雅洁
- 关键词：CD133耐药
- CD133阳性/阴性肺癌细胞的分选、鉴定及差异基因的筛选被引量：6
- 2015年
- 背景与目的研究表明多种实体肿瘤中存在肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs),肿瘤干细胞与非肿瘤干细胞的生物学特性存在已有的明显差异,而CD133被认为是肿瘤干细胞的标记物,因此CD133阳性细胞与CD133阴性细胞可能存在明显差异。本研究通过分选人肺腺癌A549细胞中的CD133阳性及CD133阴性细胞,鉴定两组细胞的生物学特性并在人组织标本进行验证,利用基因芯片筛选转移相关差异基因。方法采用磁式分选(magnetic activated cell sorting,MACS)的方法对人肺腺癌A549中CD133阳性细胞、CD133阴性细胞进行分选,通过无血清条件培养、平板克隆、血清诱导分化及基因芯片等实验,比较两组细胞"sphere"形成、细胞增殖、细胞分化以及差异基因,并在人组织标本进行CD133表达与临床特性的验证分析。结果 CD133阳性细胞能在无血清培养基中悬浮生长并形成"sphere";其平均克隆形成率(57.1%)明显高于CD133阴性细胞(3.3%);CD133阳性细胞能被血清诱导分化、表达腺癌标志物CK7;两组细胞中的19个转移基因表达水平相差两倍或以上,差异最高达12倍;肺癌组织中CD133阳性细胞主要分布于癌巢周边,数量稀少,其表达与肿瘤组织学分型、分级及临床分期无关。结论 CD133阳性肺腺癌A549细胞具有CSCs特性;两组细胞在转移相关基因的表达存在明显差异,其中CD82可能在CD133阳性细胞的转移机制中起重要作用。
- 郑少秋李书华王红艳谢晓斌张雅洁
- 关键词：CD133转移相关基因
- 可活化细胞穿膜肽-聚N-（2-羟丙基）甲基丙烯酰胺-Ad.mda-7.egfp接合物的合成及跨膜运输途径检测
- 2015年
- 目的：合成一种由可活化细胞穿膜肽（ACPP）、水溶性高分子聚合物聚N-（2-羟丙基）甲基丙烯酰胺（pHPMA）修饰腺病毒的接合物，并初步探索该接合物的跨膜运输途径。方法通过化学合成的方法合成ACPP。将肺腺癌细胞株A549、乳腺癌细胞株MDA-MB-231、肺支气管上皮细胞株HBE和肝癌细胞株HepG2均分为两组，分别加入培养基及终浓度为10 mg/L基质金属蛋白酶抑制剂强力霉素，12 h后加入ACPP，通过荧光显微镜观察并鉴定ACPP对各细胞的穿膜活性。通过化学修饰法合成接合物pc-Ad. mda-7.egfp及ACPP-pc-Ad.mda-7.egfp，通过荧光显微镜观察并初步鉴定接合物的合成和对A549细胞的穿膜活性。应用流氏细胞术检测接合物感染A549细胞的能力。通过荧光显微镜观察并鉴定接合物ACPP-pc-Ad. mda-7. Egfp在A549细胞内定位及穿膜活性。结果合成了ACPP 100 mg。ACPP对A549、MDA-MB-231、HepG2细胞株具有靶向性穿膜活性，而HBE细胞内未见绿色荧光，强力霉素组细胞经过强力霉素作用后与ACPP-FITC孵育，4种细胞内均未见明显绿色荧光反应，强力霉素阻断了ACPP的肿瘤选择性穿膜作用。合成了两种接合物pc-Ad.mda-7.egfp（粒径420.6 nm）及ACPP-pc-Ad.mda-7.egfp（粒径462.2 nm）。将ACPP-pc-Ad.mda-7.egfp、pc-Ad.mda-7.egfp接合物、Ad.mda-7.egfp与A549细胞共培养后，可见空白对照组（培养基）无绿色荧光蛋白表达，pc-Ad.mda-7.egfp接合物仅见微量绿色荧光蛋白表达，ACPP-pc-Ad.mda-7.egfp、Ad.mda-7.egfp组所有细胞均可见强烈绿色荧光蛋白表达。经流氏细胞仪检测，ACPP-pc-Ad.mda-7.egfp组A549细胞PI荧光值明显高于pc-Ad.mda-7. egfp组。经荧光显微镜观察证实接合物ACPP-pc-Ad.mda-7.egfp大量分布于A549细胞胞质，而pc-Ad. mda-7.egfp仅出现少量内吞性囊泡。结论成功合成了ACPP-pc-Ad.mda-7.egfp接合物，并证实ACPP-pc-Ad.mda-7.egfp以非内吞途径进行跨膜运输。
- 李书华许泽鹏陈艺瑛陈婷婷刘谕昆李灏马少丹张雅洁
- 关键词：蛋白质转运
- 重组腺病毒载体pDC316-hIL--24的构建及病毒滴度测定被引量：2
- 2014年
- 目的构建重组腺病毒载体pDC316-hIL-24,并测定病毒滴度。方法从HEK293细胞中提取mRNA,设计特异性引物,通过RT-PCR法扩增hIL-24基因全编码区序列。将测序正确的片段用BglⅡ和HindⅢ双酶切定向插入到pDC316-EGFP穿梭质粒中。构建重组穿梭质粒pDC316-EGFP-hIL-24,在脂质体介导下与腺病毒辅助大质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre共转染293细胞,包装产生复制缺陷型重组腺病毒pDC316-hIL-24,经HEK293细胞扩增,TCID50法测定重组腺病毒滴度。结果成功构建出表达h IL-24基因的重组腺病毒载体(pDC316-hIL-24),获得了高滴度表达hIL-24基因的重组腺病毒。结论重组腺病毒表达载体(pDC315-hIL-24)的成功构建及重组腺病毒的获得有利于进一步开展肿瘤的转基因治疗研究。
- 李书华陈婷婷刘谕昆李灏陈艺瑛张雅洁
- 关键词：重组腺病毒载体病毒滴度
- CXCR4启动子的条件复制型腺病毒对肺癌细胞的靶向杀伤作用
- 2015年
- 目的:构建CXCR4启动子的条件复制型腺病毒载体CRAd-CXCR4-GFP,探究CRAd-CXCR4-GFP对肺癌细胞的靶向杀伤效应。方法:PCR法扩增人CXCR4-E1A基因并克隆至穿梭质粒p DC316-GFP,将骨架质粒p BHG-lox-E1,3Cre和重组质粒p DC316-CXCR4-GFP共转染293细胞,产生重组腺病毒CRAd-CXCR4-GFP并扩增,扩增后进行PCR鉴定和腺病毒滴度测定;real-time PCR检测5种肺癌细胞株CXCR4的mRNA表达,筛选出表达最高的A549细胞;将CRAd-CXCR4-GFP和Ad-NULL分别转染A549细胞,检测两者转染后CXCR4启动子活性和腺病毒复制数;将CRAd-CXCR4-GFP和Ad-NULL分别转染A549细胞和16HBE细胞,流式细胞术检测各组细胞凋亡情况,CCK-8检测各组细胞活性。结果:成功构建重组质粒p DC316-CXCR4-GFP,与骨架质粒p BHG-lox-E1,3Cre共转染293细胞后第11天可见片状绿色荧光;PCR表明目的基因CXCR4-E1A已成功整合在重组腺病毒基因组中;测定重组腺病毒滴度为1×1013PFU/L;CRAd-CXCR4-GFP转染A549细胞后E1A的mRNA和E4表达较Ad-NULL组明显上升;与Ad-NULL组和空白对照组相比,CRAd-CXCR4-GFP组前4 d A549细胞凋亡率和活性无明显差异,第5天细胞凋亡率明显增加,细胞活性明显降低,各组间5 d内16HBE细胞的细胞凋亡率和细胞活性均无明显变化。结论:成功构建条件复制型腺病毒表达载体CRAd-CXCR4-GFP,该载体对肺癌细胞具有靶向杀伤作用。
- 李龙光李书华王红艳龙捷谢晓斌张雅洁
- MDA-7基因的腺病毒载体构建及对肺腺癌A549细胞凋亡的影响被引量：3
- 2014年
- 目的构建一种由腺病毒AdMax包装系统表达目的基因——黑色素瘤分化相关基因-7(MDA-7)的复制缺陷型腺病毒,并初步探索其抗肿瘤活性。方法通过基因操作技术将目的基因(MDA-7)插入到5型腺病毒AdMax包装系统的E1A区域,构建复制缺陷型腺病毒Ad.hMDA-7-EGFP;同时构建对照病毒Ad.EGFP。病毒滴度计算按寇化法(Karber法)进行腺病毒感染性滴度(TCID50)测定。应用免疫组化染色法检测MDA-7在感染2种病毒的肺腺癌A549细胞中的表达状态;通过二苯甲亚胺-碘化丙啶(Hoechst33342-PI)双染色法及流式细胞仪检测2种病毒对肿瘤细胞杀伤的差异。结果成功构建携带目的基因的腺病毒载体,经聚合酶链反应(PCR)鉴定正确;MDA-7在感染Ad.hMDA-7-EGFP的肺腺癌A549细胞中表达,以相同感染复数(MOI)值感染Ad.EGFP时肺腺癌A549细胞中未检测到MDA-7表达;Ad.hMDA-7-EGFP对肿瘤细胞株杀伤能力明显高于Ad.EGFP。结论成功构建复制缺陷型腺病毒Ad.hMDA-7-EGFP,并证实MDA-7蛋白在肿瘤细胞中过表达,诱导肺腺癌A549细胞株发生凋亡。
- 李书华龙捷王红艳谢晓斌张雅洁
- 关键词：病毒复制基因疗法复制缺陷型腺病毒
- 肺癌转移相关microRNA miR-29b的生物信息学分析被引量：4
- 2014年
- 目的:应用生物信息学分析A549细胞中在CD133阳性低表达的miR-29b的靶基因及其功能,为以miR-29b为靶点的肿瘤研究提供线索。方法:利用miRNA PCR芯片筛选A549细胞中CD133阳性和CD133阴性差异表达的miRNA,选用miRecords预测miR-29b的靶基因,合并已证实的靶基因,利用GOEAST和DAVID数据库对所得靶基因进行功能富集分析和信号转导通路富集分析。结果:A549细胞中与CD133阴性比较,miR-29b在CD133阳性中表达下调。miR-29b靶基因有106个,其靶基因功能富集于结合和细胞外基质形成等作用(P<0.01);信号转导通路显著富集于JAK-STAT和TGF-β等信号转导通路(P<0.05)。结论:miR-29b可能与肺癌转移相关,miR-29b的靶基因显著富集在与肿瘤相关的信号通路中。
- 王红艳郑少秋涂永生张雅洁
- 关键词：肺癌靶基因生物信息学
- 可活化细胞穿膜肽的设计及修饰高分子载体pHPMA的作用检测
- 2014年
- 目的合成一种可活化细胞穿膜肽ACPP,并初步探索其穿膜活性及其对高分子聚合物pHPMA的共价修饰作用。方法通过化学合成的方法合成可活化细胞穿膜肽ACPP,通过免疫荧光法检测细胞内mmp2蛋白的表达;通过荧光显微镜观察鉴定ACPP的穿膜活性。通过化学修饰法合成接合物pc-Ad.egfp及ACPP-pc-Ad.egfp。通过荧光显微镜观察及动态光散射法初步鉴定接合物的合成,通过荧光显微镜观察鉴定接合物ACPP-pc-Ad.egfp亚细胞分布。结果成功合成了可活化细胞穿膜肽ACPP;ACPP具有肿瘤靶向性穿膜活性;通过ACPP修饰高分子聚合物pHPMA合成了ACPP-pc-Ad.egfp;经荧光显微镜观察证实ACPP-pc-Ad.egfp具有较强的感染细胞的能力,并由ACPP介导大分子进行非内吞性跨膜运输。结论成功合成了ACPP,ACPP具有肿瘤靶向性穿膜活性,并成功修饰高分子聚合物pHPMA。
- 李书华罗颖洁王俊蔡君香许泽鹏陈艺瑛张雅洁
- 关键词：肿瘤靶向共价修饰
- 顺铂间歇性干预对A549中干细胞及EMT相关基因表达的影响被引量：1
- 2015年
- 目的:研究肺癌细胞A549在顺铂(DDP)间歇性干预后肿瘤干细胞(CSC)标志物(CD133)和上皮细胞间质转化(EMT)标志物(E-cadherin、β-catenin、Vimentin和Fibronectin)表达的变化,探讨肺癌耐药和CSC及EMT之间的相关性。方法:应用CCK-8法检测A549细胞对DDP的敏感性,DDP IC50间歇性处理A549细胞,采用Western blot法检测CD133蛋白表达变化,RT-q PCR法测定A549细胞处理前后E-cadherin、β-catenin、Vimentin和Fibronectin mRNA的表达。结果:肺腺癌细胞A549经DDP间歇性干预后,CSC标记物CD133蛋白表达增高,E-cadherin和β-catenin mRNA的相对表达量均显著降低,Vimentin mRNA的相对表达量显著增高。结论:A549细胞经DDP间歇性干预后有CSC标志物的表达,并表现出EMT的特性。
- 王红艳张雅洁
- 关键词：耐药肿瘤干细胞上皮细胞间质转化
