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ES细胞的三维培养与肝细胞分化的初步研究被引量：2: 2008年; 目的探索用生物材料三维培养胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES细胞)并向肝细胞分化的可行性。方法胰酶消化悬滴法形成5 d的鼠拟胚胎,将1×106/mL鼠ES细胞与细胞外基质MatrigelTM1∶1混合接种于聚乳酸(poly-L-lactic acid,PLLA)和聚乙醇酸(polyglycolic acid,PGA)共聚合三维支架内,用DMSO、地塞米松、HGF、FGF4、胰岛素等诱导ES细胞向肝细胞分化,动态观察ES细胞的培育和生长情况,并用RT-PCR、免疫荧光染色检测其肝细胞标志物白蛋白(ALB)和甲胎蛋白(AFP)的表达。结果立体显微镜见ES细胞及分化细胞在聚合支架材料上呈三维立体状态生长,并保持细胞活力,随培养时间延长不断增殖。RT-PCR检出分化细胞表达ALB mRNA和AFP mRNA,同样免疫荧光染色也证实表达ALB和AFP。结论ES细胞可在生物材料聚合三维可降解支架及MatrigelTM上生长,并在诱导剂的作用下向肝细胞分化。; 张允平王英杰张世昌刘涛; 关键词：胚胎干细胞肝细胞细胞分化生物材料

干细胞治疗肝病的研究现状: 2008年; 刘涛张世昌王英杰; 关键词：干细胞肝病

生物反应器内EBs来源细胞的肝细胞分化与成熟: 2009年; 目的观察微重力生物反应器内拟胚体(EBs)来源细胞的肝细胞分化与成熟。方法将未分化鼠胚胎干细胞(ES细胞)以1×106/mL移入微重力反应器内,在DMSO、地塞米松、FGF4、HGF等刺激作用下,进行15 d的旋转培养。采用ELISA法动态检测培养液中鼠白蛋白的产生量。培养结束时转移EBs于载玻片和培养板,分别检测EBs来源细胞的糖原储存和对靛青绿(ICG)、荧光素标记低密度脂蛋白(D iI-Ac-LDL)的摄取能力。结果在生物反应器旋转培养的第5、10 d,未从培养液中检出特异的鼠白蛋白,而在第15 d的培养液中检出一定量的鼠白蛋白。与原代培养的成熟肝细胞一样,转种的EBs来源细胞period ic ac id-Sch iff(PAS)糖原染色阳性,ICG摄取试验阳性,D iI-Ac-LDL摄取试验阳性。未分化的ES细胞均呈阴性。结论微重力生物反应器不仅能加快EBs的形成与肝细胞分化,而且能促进分化肝细胞的成熟。; 张允平王英杰张世昌刘涛; 关键词：拟胚体肝细胞细胞分化

胚胎干细胞用于肝组织工程研究的初步评价: 2009年; 目的在生物材料上进行胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESc)的三维培养和肝细胞定向诱导分化,评价其用于构建肝组织工程的可行性。方法胰酶消化生物反应器悬浮旋转培养5天的拟胚体(embryoid bodies,EBs),将细胞悬液与细胞外基质Matrigel 1∶1混合接种于聚乳酸(poly-L-lactic acid,PLLA)和聚乙醇酸(polyglycolic acid,PGA)共聚合三维支架内,用系列诱导剂定向诱导肝细胞分化。镜下动态观察ES细胞的培育和生长情况,并用HE染色、糖原染色、免疫荧光染色检测组织结构形态、肝细胞功能及其肝细胞标志物白蛋白(ALB)的表达。结果显微镜和扫描电镜见ESc可在聚合支架材料上三维立体状态生长,随培养时间不断增殖,交织成网状。HE染色提示形成了致密的类肝组织样结构。糖原染色和免疫荧光染色结果提示形成的类肝组织表达Alb,并有大量糖原存在。结论可在PLLA/PGA三维支架材料及Matrigel上培养ESc和定向肝细胞诱导分化,长时间培养后可形成类肝样组织。; 刘涛王英杰张世昌陈霞李桂清; 关键词：胚胎干细胞肝组织细胞分化生物材料

鼠拟胚体来源细胞向肝细胞及心肌细胞分化的初步观察被引量：1: 2008年; 目的观察微重力生物反应器内拟胚体(EBs)的形成及其EBs来源细胞的肝细胞与心肌细胞分化。方法将未分化鼠胚胎干细胞(ES细胞)以1×106/mL移入微重力反应器内旋转培养,6d后取出反应器内形成的EBs接种于培养板培养,使用含DMSO、地塞米松等IMDM培养液继续培养10d。动态观察EBs形成和EBs来源细胞分化细胞形态特征,采用Western blot、免疫荧光染色方法检测EBs来源细胞肝细胞及心肌细胞标志物的表达。结果生物反应器旋转培养6d形成均一的拟胚体,接种后移行细胞中出现肝细胞特征样细胞和自发性搏动细胞,Western blot检测到EBs来源细胞肝细胞标志物Alb表达,免疫荧光染色分别检测出肝细胞标志物Alb、AFP和心肌细胞标志物GATA4的表达。结论微重力生物反应器可加快EBs的形成,EBs来源细胞可有效地向肝细胞及心肌细胞分化,两种细胞之间可能存在相互作用。; 刘卫生王英杰刘涛张世昌; 关键词：拟胚体细胞分化肝细胞心肌细胞

胚胎干细胞在可降解聚合三维支架上的生长增殖与分化被引量：1: 2008年; 目的：三维可降解生物材料是组织工程的重要载体,观察胚胎干细胞在聚合三维支架上的生长、增殖和分化状态,为胚胎干细胞分化形成任何组织修复替代治疗机体组织器官的损伤和功能衰竭提供实验学依据。方法：实验于2007-05/09在解放军第三军医大学西南医院感染病研究所人工肝实验室完成。①材料：鼠胚胎干细胞CCE株为加拿大Stem Cell Technologies公司产品,由聚乳酸和聚乙醇酸聚合而成的非编织型三维支架为美国Synthecon公司产品,细胞外基质Matrigel TM由BD Biosciences公司提供。②实验方法：将鼠胚胎干细胞株接种于被覆明胶的培养瓶内,加入含0.1mmol/L非必需氨基酸、2mmol/LL-谷酰胺、0.1mmol/L二羟基丙硫醇、15%胎牛血清、1000U/mL白血病抑制因子的IMDM培养液。3d后采用＂悬滴法＂使细胞在不含白血病抑制因子的上述IMDM培养液中形成胚胎体,6d后胰酶消化得到胚胎干细胞,浓度调整为（3-4）×109L-1,与Matrigel TM按1∶1混合并接种于剪成5mm×4mm×1mm小片的三维支架内,加入含1%二甲基亚酚、10-7mol/L地塞米松、5mg/LITS、15%胎牛血清的IMDM培养液进行诱导分化。③实验评估：激光共聚焦显微镜观察胚胎干细胞在三维支架上的生长与增殖情况;应用荧光染色检测细胞活性;苏木精-伊红染色光镜下观察胚胎干细胞的组织分化情况。结果：①细胞生长与增殖：接种培养1d多数胚胎干细胞粘连在一起形成聚集体,状似球形,附着于三维支架的纤维上。7d时聚集的胚胎干细胞开始沿纤维支架生长,互相粘连,呈片状和网状。细胞数随培养时间延长而不断扩大,至14d细胞交织在一起呈现多层面立体景象,布满整个三维支架。②活细胞观察：接种培养1,7,14d的胚胎干细胞绝大多数发出绿色荧光,始终保持良好的细胞活性。③胚胎干细胞的组织分化：在非特异诱导培养液作用下,胚胎干细胞可向�; 刘卫生王英杰张世昌刘涛; 关键词：胚胎干细胞分化生物材料

模拟微重力条件下小鼠拟胚体形成及分化的初步观察被引量：4: 2008年; 目的研究模拟微重力条件下小鼠胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESc）拟胚体（embryoid bodies，EBs）的形成及分化。方法胰酶消化普通培养的小鼠胚胎干细胞，调整细胞数为1×10^6·ml^-1，移入可模拟微重力的旋转型生物反应器内进行培养，显微镜动态观察鼠EBs的形成，苏木精-伊红染色观察ESc的组织细胞分化情况，检测培养过程中乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）的漏出量。取不同时相的EBs，接种6孔培养板培养3～5d，倒置相差显微镜观察EBs来源细胞的分化。结果生物反应器旋转培养24h即可肉眼观察到大量多细胞聚集体形成，相差显微镜和立体显微镜下发现，72h后细胞聚集体进一步形成均一的EBs。随培养时间延长EBs体积不断增大，并不断有新的EBs出现。HE染色显示，EBs中的ESc呈现多组织多细胞分化特征，培养后期（12d以后）较大EBs中心有不同程度的坏死，伴LDH漏出量的明显升高。接种EBs于6孔培养板后，镜下观察到不同类型的细胞，如内皮样细胞、成纤维样细胞、肝细胞样细胞、血管样结构以及可自发性搏动的心肌样细胞。结论ESc在模拟微重力条件下可大量快速形成EBs，伴有不同类型的组织细胞分化。旋转型生物反应器可作为ESc研究的有用工具。; 刘卫生王英杰刘涛张世昌; 关键词：胚胎干细胞拟胚体分化生物反应器微重力

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国家自然科学基金(30670526)

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