农业部畜禽病毒学重点开放实验室基金
- 作品数：8 被引量：19H指数：3
- 相关作者：吴润刘湘涛陈豪泰谢庆阁伍志伟更多>>
- 相关机构：中国农业科学院兰州兽医研究所甘肃农业大学更多>>
- 发文基金：兰州兽医研究所所长基金中国农业科学院兰州兽医研究所所长基金更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 偶蹄动物朊蛋白基因变异性和其系统发生关系分析被引量：1
- 2006年
- 目的为明了偶蹄动物PrP基因的结构特征及其变异与结构、功能和朊粒病传染种间屏障的关系以及系统发生关系;方法利用DNAstar和Clustalx程序及treev32软件进行了22种偶蹄动物的43个完整PrP基因序列的同源性分析、多重排比和进化树构建;结果不同种属偶蹄动物的PrP基因完整ORF大小有所差异,范围为768～795bp,可编码255～264个氨基酸的朊蛋白。核苷酸和氨基酸序列的同源性,偶蹄动物间≥88.6%和≥93.3%,反刍动物间≥95.4%和≥96.5%。共发现40个点突变和2个突变区。在N-端柔韧无序“尾”区(25～135)以八肽重复缺失为主,球形结构域区(136～241)以点突变为主,点突变主要簇聚在S1β-折叠前的柔韧无规卷曲区的C-端部分和HCα-螺旋内。氨基酸104～135区和球形结构域区存在有8个高突变位点。已知PrP肽基元和功能位点如芳烃回文序列基元、2个N-连接糖基化位点、2个苏氨酸磷酸化位点、1个酪氨酸硫化位点、形成二硫键的2个半胱氨酸以及GPI锚锚着点丝氨酸为偶蹄动物所共有,各种间变异体的各结构模式非常一致。进化关系分析,可将偶蹄动物PrP基因区分为3大类,反刍动物PrP基因分为3小类。令人意外的是,2个双峰驼PrP基因的进化关系与牛属动物基因同源。结论偶蹄动物的PrP基因是一个保守基因,氨基酸104～135区和球形结构域区内的8个高突变位点可能是影响分子间相互作用、形成朊粒病传染种间屏障的主要位点,物种间各氨基酸变异并不影响PrP的主要结构和功能。
- 吴润陈怀涛谢庆阁
- 关键词：偶蹄动物朊蛋白基因结构特征分子进化
- 羊朊蛋白基因的克隆和序列分析被引量：6
- 2005年
- 分别从6只羊(3只藏绵羊和3只山羊)全血中提取基因组总DNA,用所设计引物以聚合酶链式反应扩增出细胞型朊蛋白(PrPC)基因,并克隆到pMD18-T载体。序列分析表明所克隆的羊PrP基因片段大小为771bp,包含了羊朊蛋白基因的完整编码区序列,为包含在单一外显子内的完整开放阅读框,其与国外报道的已知序列基本相同。所克隆的羊PrP基因含5个短而富含G-C的元件,可编码八肽Pro-His-Gly-Gly-Gly-Trp-Gly-Gln或九肽Pro-Gln/His-Gly-Gly-Gly-Gly-Trp-Gly-Gln。这些PrP基因序列相比较,其核苷酸序列和推导氨基酸序列同源性分别在99.0%~100.0%和98.1%~100.0%之间。共发现17个碱基替换,其中6个为同义码替换、11个为异义突变。异义突变中,除SY200301~SY200303的S240P和MY200301的M112T外,其余均位于PrP氨基酸125~228的C-端球形结构区,分别为MY200301的G129S突变、MY200302的T191R突变、MY200303的G127S突变及SY200302和SY200303的H143R和R211G。6个羊PrP基因均为密码子136、154和171的PrPARQ等位基因。
- 吴润谢庆阁刘湘涛陈豪泰
- 关键词：藏绵羊山羊朊蛋白基因DNA克隆
- 双峰驼朊蛋白基因的克隆和序列分析被引量：1
- 2005年
- 分别从4峰双峰驼全血中提取基因组总DNA,用所设计的引物扩增了细胞型朊蛋白(PrP)基因,并克隆到pMD 18-T载体.序列分析表明,所克隆的4个双峰驼PrP基因片段大小分别为768、768、792和795 bp,包含了朊蛋白基因的完整编码区序列,为包含在单一外显子内的完整开放阅读框,均与国外报道的同属单峰驼PrP序列基本相同.4个双峰驼PrP基因含5个或6个短而富含G-C的元件,可编码5个或6个八肽(九肽)重复序列Pro-His-Gly-Gly-Gly-Trp-Gly-Gln或Pro-Gln/His-Gly-Gly-Gly-Gly-Trp-Gly-Gln,其氨基酸序列含有24个氨基酸的N-端信号肽和22个氨基酸(除LT200302为23个氨基酸外)的C-端信号肽.4个双峰驼PrP基因之间相比较,其核苷酸和推导氨基酸序列的同源性为91.0%～100.0%和94.2%～100.0%.共发生133个碱基替换,其中107个为同义码替换,26个为异义突变.
- 吴润陈豪泰刘湘涛谢庆阁
- 关键词：双峰驼朊蛋白基因DNA克隆
- 牛朊蛋白单氨基酸变异体的原核表达
- 2005年
- 应用pGEX原核表达载体构建了牛朊蛋白的1个正常重组蛋白和3个单氨基酸变异体的原核表达质粒,即pGEX-BoPrP(93～241)、pGEX-BoPrP(93～241)(S154N)、pGEX-BoPrP(93～241)(A129V)和pGEX-BoPrP(93～241)(Q234R).经转化E.coli BL21(DE3),均表达了预期大小约为42.4 ku的融合蛋白.在优化的诱导表达条件下,各重组菌可产生表达量占细菌总蛋白量30%～45%的融合蛋白.经免疫印迹检查,所有融合蛋白均可与抗牛单克隆抗体4C11反应.表明,单氨基酸突变并不影响单抗4C11的识别表位.
- 陈建华吴润刘湘涛陈豪泰
- 关键词：氨基酸变异体朊蛋白原核表达质粒表达载体构建蛋白量
- 藏绵羊朊蛋白基因的原核表达被引量：3
- 2006年
- 从藏绵羊全血中提取基因组总DNA，用所设计的引物以聚合酶链式反应扩增出细胞型朊蛋白（PrP^c）基因。测序分析表明，所克隆的羊PrP^c基因片段大小为771bp，包含了羊朊蛋白基因的完整编码区序列，其与国内外报道的序列基本相同。将目的基因与经EcoRⅠ和XhoⅠ酶切的载体pGEX-4T-1连接后转化宿主菌BL21（DE3），挑选重组阳性菌用IPTG诱导表达，收集不同培养时间的菌液进行SDS-PAGE和Western-blotting。结果表明，PrP基因在大肠杆菌中成功表达，并能被抗牛PrP^c单抗4C11识别。凝胶薄层扫描结果显示，表达蛋白约占菌体总蛋白的309／6～45％，目的蛋白以包涵体的形式存在，包涵体经变性裂解、纯化和复性后得到具有一定生物学活性的目的蛋白。
- 陈豪泰吴润刘湘涛谢庆阁
- 关键词：藏绵羊原核表达
- 马麝朊蛋白(PrP)基因的克隆和序列分析
- 2005年
- 从马麝的全血中提取基因组总DNA,用所设计引物以聚合酶链式反应扩增出细胞型朊蛋白(PrPC)基因,并克隆到pMD18-T载体。序列分析表明所克隆的马麝PrP基因片段大约为771bp,包含了朊蛋白基因的完整编码区序列,即包含在单一外显子内的完整开放阅读框,与国外报道的同科动物PrP基因序列基本相同。马麝PrP基因含5个短而富含G-C的元件,可编码5个八肽(九肽)重复Pro-His-Gly-Gly-Gly-Trp-Gly-Gln或Pro-Gln/His-Gly-Ala/Gly-Gly–Gly-Trp-Gly-Gln,其氨基酸序列含有24个氨基酸的N-端信号肽和23个氨基酸的C-端信号肽。与白尾鹿(Odocoileusvirginianus)和麋鹿(Cervuselaphus)的PrP基因相比,其核苷酸序列和推导氨基酸序列同源性分别为97.4%、97.9%和98.1%、97.7%。共发生15个碱基替换,其中10个为同义码替换,5个为异义突变,即G57A、S100N、N173S、T177N和M208I。
- 陈豪泰吴润刘湘涛
- 关键词：马麝朊蛋白基因克隆
- 牛脑组织中朊蛋白的免疫组织化学检测
- 目的对牛脑组织中存在的朊蛋白（prion protein,PrP）进行定性和定位检测。方法采集甘肃省河西黄牛新鲜脑组织制作冰冻切片,部分切片用蛋白酶K消化,以4C11单抗和自制抗血清为一抗,应用免疫组化法（IHC）进行检...
- 伍志伟吴润王红宁
- 关键词：免疫组化PRPCPRPSC
- 文献传递
- 原核表达牦牛朊蛋白的纯化及其活性测定被引量：7
- 2005年
- 以原核表达的GST-BoPrP(23～242)融合蛋白为抗原,免疫BALB/C小鼠,制备抗牦牛朊蛋白的特异性抗血清。经Western blotting和间接ELISA鉴定,该抗血清可与牦牛重组成熟PrP(23～242)和牛脑组织提取物发生反应,蛋白酶K消化各抗原可消除免疫反应,但不与GST蛋白和E.coli BL21(DE3)的菌体蛋白发生反应,表明该抗血清为抗牦牛重组成熟PrP(23～242)的抗血清,其效价高达1∶12800,并能识别黄牛脑组织中的天然朊蛋白。原核表达的GST-BoPrP(23～242)融合蛋白能有效地刺激免疫动物产生PrP特异性抗体,所制备的抗血清可适用于天然朊蛋白的检测。
- 伍志伟吴润刘湘涛陈豪泰
- 关键词：牦牛纯化活性测定抗血清原核表达疯牛病
- 牦牛和双峰驼重组朊蛋白的原核细胞表达被引量：5
- 2006年
- 应用重组DNA技术构建了牦牛和双峰驼重组朊蛋白的4个表达载体，即pGEX-BoPrP（23～242）、pGEX—BoPrP（100～242）、pGEX—CaPrP（25～241）和pGEX—CaPrP（93～241），经转化E．coli BL21（DE3），成功地获得了重组菌E．coli BoPrP（23～242）、E．coli BoPrP（100～242）、E．coli CaPrP（25～241）和E．coli CaPrP（93～241），分别可表达大小约为50．2、41．7、49．9和42．4ku的融合蛋白。各重组菌经1．0mmol／L的IPTG于37℃诱导5～6h可产生占细菌总蛋白量30％～45％的融合蛋白。免疫印迹分析表明，除融合蛋白GST—BoPrP（100～242）外，GST—BoPrP（23～242）、GST—CaPrP（25～241）和GST—CaPrP（93～241）均可与抗牛单克隆抗体4C11反应，显示中国黄牛PrP^c与牦牛和双峰驼PrP^c具有共同的抗原成分。
- 吴润陈豪泰刘湘涛谢庆阁
- 关键词：牦牛双峰驼原核细胞表达
