国家自然科学基金(30200256)
- 作品数：7 被引量：13H指数：3
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- 人细胞周期蛋白D1在大肠杆菌BL21中的表达及纯化被引量：1
- 2006年
- 将人细胞周期蛋白D1全长cDNA克隆入原核表达载体pET-28c(+)中,经酶切和测序鉴定正确的重组质粒转化E.coli BL21(DE3)后获得表达菌株.该菌株经IPTG诱导高效表达出带有组氨酸标签的以包涵体形式存在的融合蛋白,表达量占菌体总蛋白的23%.包涵体经洗涤和溶解,在变性条件下利用N i2+螯合柱纯化、尿素梯度复性后,得到纯度达98%以上的纯化蛋白.SDS-PAGE显示纯化蛋白的分子量约为43 000,W estern-blot分析表明,在相应分子量处有一特异性条带,说明成功表达和纯化重组人细胞周期蛋白D1.
- 李桂英邹德生周立宏曹玉华
- 关键词：包涵体融合蛋白蛋白质纯化大肠杆菌
- 抗人Cyclin D1人源单链抗体AD9的表达及活性分析
- 2008年
- 目的原核表达、纯化抗人cyclin D1人源单链抗体(AD9)并对其活性进行分析。方法将含有AD9基因片段的噬菌粒转化大肠杆菌HB2151后,IPTG诱导表达,ELISA鉴定培养上清具有与cyclin D1蛋白结合活性后,经硫酸铵沉淀,His Trap HP亲和纯化,获得抗人cyclin D1人源单链抗体(AD9),进一步利用ELISA和Western blot对其进行鉴定和活性分析。结果IPTG诱导AD9可溶性表达,培养上清经硫酸铵沉淀和亲和纯化后,获得纯度达95%的单链抗体蛋白,ELISA和Western blot结果表明,诱导上清及纯化的AD9均能够与人Cyclin D1蛋白有特异性结合,AD9的分子量约为30kDa。结论成功地可溶性表达和纯化了,具有较好的结合人Cyclin D1蛋白活性的抗人Cyclin D1人源单链抗体。
- 曹玉华李善玉陈勇邹德生田宇郝东云李桂英
- 关键词：D1蛋白单链抗体
- L-plastin启动子调控下的肿瘤细胞特异性表达载体的构建及活性分析被引量：4
- 2007年
- 目的:构建肿瘤细胞特异性表达载体pcDNA3.1PLN-GFP及鉴定活性。方法:用2.4kb的L-plastin启动子,以绿色荧光蛋白(GFP)为报告蛋白,通过分子克隆技术,构建真核表达载体pcDNA3.1PLN-GFP,用脂质体介导法转染肿瘤细胞和成纤维细胞后,流式细胞术(FACS)分析载体的肿瘤细胞特异性和活性。结果:仅在表达内源性L-plastin的肿瘤细胞和转化的293细胞中有GFP的表达,发光细胞比率较高,而且L-plastin启动子的活性与CMV启动子活性相当,而在其它细胞中没有检测到GFP的表达。结论:我们构建的pcDNA3.1PLN-GFP是一肿瘤特异性的高效表达载体。
- 李桂英孙红光王磊田宇杜柏榕朱迅
- 关键词：肿瘤特异性GFP
- 特异性抗人cyclin D1人源单链抗体的筛选被引量：5
- 2006年
- 目的从噬菌体抗体库中筛选人源性抗人cyclinD1蛋白的单链抗体并进行鉴定。方法以原核表达并用Ni-NTA Agarose纯化的重组人cyclinD1蛋白为抗原,通过“吸附-洗脱-扩增”淘选过程从噬菌体抗体库中筛选特异性抗人cyclinD1蛋白的单链抗体,通过ELISA方法对获得抗体的特异性和结合活性进行分析鉴定。结果经过4轮筛选,获得7株能与人cyclinD1蛋白结合的阳性克隆,其中3株噬菌体的可溶性表达单链抗体能与人cyclinD1蛋白有特异性结合活性。结论利用噬菌体抗体库技术可以不经免疫过程制备出特异性的人源性抗人cyclinD1抗体。
- 李桂英朱迅周立宏邹德生郝东云田宇杜柏榕
- 关键词：噬菌体抗体库单链抗体
- 抗Cyclin D1胞内抗体AD5N基因真核表达载体的构建及其对乳腺癌细胞增殖的抑制作用被引量：3
- 2008年
- 目的:构建细胞核定位的抗Cyclin D1胞内抗体基因的真核表达载体并分析其对乳腺癌细胞增殖的抑制效应。方法:利用PCR技术和分子克隆技术,构建编码细胞核定位的抗Cyclin D1胞内抗体基因(AD5N)的真核表达载体pcDNA3.1-AD5N,利用脂质体介导法转染MCF-7细胞,RT-PCR、间接免疫荧光、Western blot和流式细胞术分析该胞内抗体基因AD5N在MCF-7细胞中的表达、定位及抑瘤效应。结果:经限制性内切酶分析及序列分析发现,成功构建编码细胞核定位的抗Cyclin D1胞内抗体(AD5N)基因的真核表达载体pcDNA3.1-AD5N,基因片段为855 bp,编码285个氨基酸,分子量约为30 kD。RT-PCR、免疫荧光及Western blot实验结果显示,仅在转染胞内抗体基因的MCF-7细胞中存在该胞内抗体的表达,并且主要分布在细胞核区域。与野生型MCF-7细胞和转染空质粒的细胞相比,在MCF-7/pcDNA3.1-AD5N细胞中AD5N的表达可明显抑制MCF-7细胞增殖,显著诱导细胞凋亡(P<0.01),使G0-G1期细胞周期指数增高12.64%,S期指数下降15.22%,凋亡细胞指数上升9.15%。结论:细胞核定位的抗Cyclin D1胞内抗体AD5N基因的表达,可有效抑制乳腺癌细胞的增殖,阻滞细胞周期进展,并诱导细胞凋亡。
- 周立宏朱迅曹玉华王磊陈勇杜柏榕李桂英
- 关键词：CYCLIN胞内抗体核定位乳腺癌
- 内质网滞留型抗CyclinD1胞内抗体在HeLa细胞中的表达分析
- 2008年
- 目的构建内质网滞留型的抗CyclinD1胞内抗体并鉴定其在肿瘤细胞中的表达活性。方法利用PCR技术将细胞内质网滞留信号及E-tag检测标签引入抗CyclinD1人源单链抗体,获得抗CyclinD1胞内抗体(AD5E)基因片段,通过分子克隆技术,构建重组真核表达载体pcDNA3.1-AD5E,限制性内切酶分析及DNA测序验证其序列及读码框正确后,利用脂质体介导法转染HeLa细胞,RT-PCR和间接免疫荧光实验分析该胞内抗体在肿瘤细胞中的表达活性。结果限制性内切酶分析及DNA测序发现,正确引入细胞内质网滞留信号和E-tag检测标签序列,该胞内抗体片段为876bp。RT-PCR及免疫荧光实验结果显示,仅在转染胞内抗体基因的HeLa细胞中存在该胞内抗体的表达,并且主要分布在细胞质区域。结论我们成功构建了在肿瘤细胞中能够有效表达的内质网滞留型的抗CyclinD1胞内抗体。
- 周立宏朱迅田宇陈勇曹玉华冯晶李桂英
- 关键词：CYCLIND1胞内抗体肿瘤
- 以绿色荧光蛋白为报告蛋白检测真核表达载体pcDNA3.1PLN中L-plastin启动子的活性
- 肿瘤基因治疗的关键是目的基因能否在体内被有效的导入特定的肿瘤组织细胞,并实现靶向高效表达。解决这一问题的主要策略是通过利用肿瘤组织/细胞特异性启动子调控治疗基因靶向表达。近年来几项研究结果显示,2.4kb的L-plast...
- 李桂英孙红光朱迅杜柏榕
- 文献传递
- 抗Cyclin D1胞内抗体AD5N对宫颈癌HeLa细胞的影响被引量：1
- 2008年
- 目的:抗Cyclin D1胞内抗体AD5N对宫颈癌细胞增殖的抑制效应分析。方法:将携带抗Cyclin D1胞内抗体AD5N的真核表达载体pcDNA3.1-AD5N,利用脂质体介导法稳定转染宫颈癌HeLa细胞,G418筛选阳性细胞株,进一步通过Westernblot、MTT法及流式细胞术分析该胞内抗体的细胞内表达和抗肿瘤效应。结果:AD5N在稳定筛选的细胞株中有效表达,与空细胞和空质粒转染的细胞株相比,明显抑制HeLa细胞增殖,并诱导细胞凋亡(P<0.01),细胞周期G0-G1期指数增高10.35%,S期指数下降15.77%,凋亡细胞指数上升6.38%。结论:抗Cyclin D1胞内抗体AD5N基因的表达,抑制宫颈癌细胞的增殖,阻滞细胞周期进展,并诱导细胞凋亡。
- 周立宏朱迅曹玉华陈勇田宇王磊李桂英
- 关键词：CYCLIND1胞内抗体增殖宫颈癌
