质检公益性行业科研专项项目(201310093)
- 作品数：9 被引量：23H指数：4
- 相关作者：聂福平王昱杨俊李应国王国民更多>>
- 相关机构：重庆大学西南大学重庆出入境检验检疫局更多>>
- 发文基金：质检公益性行业科研专项项目国家质检总局科技计划项目国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：农业科学更多>>
- 副猪嗜血杆菌LAMP检测方法的建立被引量：3
- 2018年
- 为建立快速鉴别检测副猪嗜血杆菌的方法,根据Gen Bank中公布的副猪嗜血杆菌16S rRNA基因设计环介导等温扩增（LAMP）引物,利用Loopamp Realtime Turbidimeter LA-320c仪对反应体系和条件进行优化,建立了检测副猪嗜血杆菌的LAMP方法。结果显示,该方法可在65℃下反应15 min实现肉眼可视化直接判定结果。该方法仅对副猪嗜血杆菌有特异扩增,对胸膜肺炎放线杆菌、肠炎沙门菌等其他10种相关病原菌均无特异性扩增,表明特异性好,且具有较好的重复性及稳定性。其检测的灵敏度为0.175 fg/L,高于PCR方法1×10~4倍。对94份临床发病猪的鼻拭子样品平行检测结果显示,LAMP方法与NY/T 2417—2013标准中的方法间的符合率为96.8%。本方法为基层和口岸快速鉴别诊断副猪嗜血杆菌病提供了新的技术手段。
- 刘亚娟聂福平聂福平杨俊吴蕊唐昌杰王国民李应国
- 关键词：副猪嗜血杆菌RRNA基因LAMP
- 小反刍兽疫病毒竞争ELISA检测试剂盒生产工艺研究被引量：1
- 2014年
- 为研究小反刍兽疫病毒(PPRV)竞争ELISA试剂盒的生产工艺,本试验利用昆虫细胞表达的PPRV核蛋白及其单克隆抗体,建立一种特异性高、敏感性强的PPRV竞争ELISA检测方法,并对该方法的各个步骤进行优化,确定该方法的最适条件,从而确定竞争ELISA的操作程序。并用该方法与OIE推荐的PPRV rC-ELISA抗体检测试剂盒同时检测来自西藏、内蒙古共977份临床羊、牛血清样本,结果显示特异性、敏感性、符合率分别达99.89%、93.82%、99.38%。本研究建立的PPRV竞争ELISA方法为该病毒检测试剂盒的研制奠定技术基础,为小反刍兽疫的防控提供科学依据。
- 刘晓慧杨云庆叶玲玲祝贺吕建强赵文华颜红尹尚莲花群义杨仕标张光培周晓黎董俊艾军
- 关键词：小反刍兽疫病毒N蛋白单克隆抗体竞争ELISA
- 猪衣原体实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用被引量：4
- 2014年
- 为了建立猪衣原体（Chlamydia suis ）实时荧光定量 PCR（real-time PCR）检测方法，根据猪衣原体（C．cuis ）的 MOMP 基因，选取高度特异保守的区域，设计实时荧光定量 PCR 引物和探针，并构建了重组质粒。结果显示，该方法建立的标准曲线方程为：Y＝-3．2147x＋41．218，线性相关系数为0．9991，扩增效率为104．6％，最低检测量为1．7＆#215;102 copies ！μL。该检测方法特异性较好，与鹦鹉热亲衣原体、流产亲衣原体、沙眼衣原体、肺炎嗜衣原体、牛羊亲衣原体、鼠衣原体无交叉反应。批内和批间重复试验的变异系数在0．458％～1．174％范围内，具有较好的重复性；与普通 PCR 方法相比较，该方法具有较高的检出率。建立对猪衣原体的监测和流行病学调查都具有非常重要的意义。
- 袁曾壮王昱聂福平杨俊李应国肖进文王国民李贤良刘力
- 关键词：猪衣原体实时荧光定量PCR
- 家畜嗜衣原体TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法的建立被引量：5
- 2015年
- 为快速检测家畜嗜衣原体,选取家畜嗜衣原体主要外膜蛋白(MOMP)基因的高度保守区域,设计特异性引物和探针,通过对反应条件的优化,建立家畜嗜衣原体TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法。结果显示,该方法的最低检测限为2.8×10copies/μL,在2.8×102~2.8×106 copies/μL范围内具有良好的线性关系,其标准曲线方程为y=-3.281 5x+41.396,线性相关系数r2=0.999 4,扩增效率为101.7%;该方法可特异性检测家畜嗜衣原体,对肺炎嗜衣原体、沙眼衣原体、鹦鹉热嗜衣原体、流产嗜衣原体等6种动物衣原体无交叉反应,特异性好;其批间重复试验和批内重复试验的变异系数分别为0.170 2%~0.467 2%、0.331 4%~2.796%,重复性良好。采用本试验建立的方法与OIE推荐的方法进行比较,二者的结果表现出良好的符合率。该方法的建立为家畜嗜衣原体的早期检测和流行病学调查提供了有效的检测手段。
- 叶自霞杨俊聂福平王昱袁曾壮李应国王国民李贤良保雨刘亚娟刘力
- 关键词：荧光定量PCR
- 猪六种重要病原寡核苷酸芯片检测方法的初步建立被引量：1
- 2016年
- 为建立同时鉴别检测猪传染性胸膜肺炎放线杆菌（APP）、副猪嗜血杆菌（HPS）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪肺炎支原体（Mhp）、猪圆环病毒2型（PCV2）和猪瘟病毒（CSFV）这6种病原的寡核苷酸芯片方法,根据这6种病原的特异保守序列,设计了6对特异性引物和探针,建立多重PCR体系,优化杂交参数,进行方法评估。结果显示,该方法检测APP、HPS、Mhp、PCV2、PRRSV及CSFV的灵敏度分别为5.8×10^2copies/L、7.8×10^3copies/L、6.8×10^3copies/L、6.3×10^2copies/L、4.8×10^3copies/L、5.5×10^2copies/L,且与猪源伪狂犬病病毒、猪细小病毒、日本乙型脑炎病毒、猪水疱病病毒、水泡性口炎病毒、口蹄疫病毒、蓝舌病病毒、小反刍兽疫病毒及沙门菌等9种病原无交叉反应。用建立的多重PCR对186份临床样本的检测结果显示,单一感染率为18.3%（34/186）,混合感染率为5.9%（11/186）,与测序验证完全一致。该方法为多种病原的流行病学调查和临床诊断提供了一种快速、高通量的检测手段。
- 保雨聂福平杨俊王昱刘亚娟王国民李贤良李应国张超刘力
- 关键词：寡核苷酸芯片HPSMHPPCV2PRRSVCSFV
- 沙门菌夹心DNA杂交检测方法的建立被引量：3
- 2015年
- 为建立简便快速、特异检测沙门菌的方法,根据沙门菌invA基因序列,分别设计特异的捕获探针和检测探针,通过探针与目标rRNA结合,优化反应条件,建立了检测沙门菌的夹心DNA杂交方法。该方法在1.5h内即可完成全过程检测,加入TMB显色液可直接肉眼观察结果或采用酶标仪测定D450nm值判定结果。该方法对其他相关病原菌均无特异性反应,最低检测限为1.2CFU/mL,具有良好的精确度。批内变异系数在16.53%~17.97%之间,批间变异系数在16.33%~22.10%之间。本方法的建立为沙门菌的大批量、快速检测和防控提供了新的技术手段。
- 刘亚娟聂福平张超杨俊王昱石宝石保雨王国民李贤良李应国刘力
- 关键词：沙门菌
- 流产嗜衣原体TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法的建立被引量：7
- 2015年
- 为建立一种快速、准确检测流产嗜衣原体(C.abortus)Taq Man-MGB荧光定量PCR方法,本研究根据C.abortus主要外膜蛋白基因的特异保守序列设计引物及探针,并优化反应条件,建立了检测C.abortus的荧光定量PCR方法。结果表明,以重组质粒为标准品建立的标准曲线在1.6×103拷贝/μL^1.6×107拷贝/μL内具有良好的线性关系,相关系数为0.9999。该方法仅对C.abortus的靶基因扩增呈阳性,而对鹦鹉热嗜衣原体、家畜嗜衣原体、鼠衣原体、沙眼衣原体、肺炎嗜衣原体、猪源衣原体核酸扩增结果均为阴性,特异性强;其最低检出限为1.6拷贝/μL;组内和组间重复性试验变异系数均小于3%,具有良好的重复性。利用建立的方法和普通PCR方法同时对225份临床样品进行检测,结果显示荧光定量PCR检出率比普通PCR高4.5%,表现较高的灵敏度和准确性。本研究建立的方法对C.abortus的临床鉴别检测和疾病诊断具有重要意义。
- 保雨聂福平王昱杨俊袁曾壮叶自霞刘亚娟张姜琳吴蕊田郡王国民刘力李应国
- 关键词：荧光定量PCR
- 蓝舌病病毒10型和20型及23型多重RT-PCR检测方法的建立被引量：1
- 2018年
- 为建立可同时鉴别检测蓝舌病病毒（BTV）10型、20型及23型的方法,本研究针对这三型病毒VP2基因保守区,设计合成了3对特异性引物,经过条件优化,建立了单管同时鉴别BTV 10型、20型、23型的多重RT-PCR方法。结果显示,该方法可同时扩增出BTV 10型696 bp、BTV20型293 bp和BTV 23型356 bp三条特异性的片段,对BTV其他基因型以及小反刍兽疫病毒（PPRV）、口蹄疫病毒（FMDV）的核酸均无扩增;该方法最低可检测1.696×103copies/L的BTV10、1.375×103copies/L的BTV20和1.317×103copies/L的BTV23。利用建立的多重RT-PCR方法对67份临床样品进行检测,结果与OIE推荐的BTV套式RTPCR方法符合率为100%。本研究建立的多重RT-PCR检测方法特异性好,具有较强的检测敏感性,可用于蓝舌病病毒血清型的鉴别。
- 黄秋华聂福平周庆杨俊王昱艾军唐昌杰陈冉越李应国王国民胡世君
- 关键词：蓝舌病病毒多重RT-PCR
- 羊痘病毒属病毒多重TaqMan MGB荧光定量PCR检测方法的建立被引量：5
- 2018年
- 为建立同时快速鉴别检测羊痘病毒属病毒(CaPV)的方法,本研究设计了一对针对CaPV的通用引物和3条特异性的TaqMan MGB探针,并对其反应条件进行优化,建立了单管同时鉴别检测3种病毒的多重TaqMan MGB荧光定量PCR方法。结果显示,该多重荧光定量PCR方法仅对牛结节性皮肤病病毒(LSDV)、山羊痘病毒(GTPV)和绵羊痘病毒(SPPV)有特异性扩增,而对牛痘病毒等其它相关病毒核酸无扩增。在10~2拷贝/μL～107拷贝/μL浓度范围内有良好的线性关系;对LSDV、 GTPV、SPPV的最低检测限分别为14.8拷贝/μL、32.9拷贝/μL、26.7拷贝/μL。标准曲线相关系数(R2)均为0.999。批内及批间变异系数均小于1.5%。应用本研究建立的方法和OIE陆生动物手册推荐普通PCR方法分别对185份临床样品和67份模拟样品进行检测,该方法检出率比普通PCR方法高约1.6%。本研究建立的CaPV多重TaqMan-MGB荧光定量PCR方法具有特异性强、敏感性高、重复性好、操作简便快速等优点,适用于CaPV临床样品的快速鉴别检测。
- 聂福平聂福平刘念源杨俊唐昌杰韩雪清韩雪清陈军候长军候长军
