国家自然科学基金(30870957)
- 作品数：8 被引量：17H指数：2
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- 转录因子CTCF与表观遗传及疾病的关系被引量：1
- 2012年
- CTCF是普遍存在于真核生物中的多功能转录因子，通过其11锌指结构可与多种基因和蛋白质结合而广泛参与基因的表达调控，表现出各种生物学功能。CTCF参与染色质重塑和基因印迹等表观遗传调控并且起关键作用。CTCF参与的调控若发生异常将引起生长发育或神经功能异常等疾病。作者就近年来CTCF与表观遗传、疾病之间的关系作一介绍。
- 刘秋英覃扬
- 关键词：基因调控表观遗传
- 人VIGILIN参与调控肝癌细胞H19和IGF2印记基因表达的研究被引量：2
- 2009年
- 目的探讨人高密度脂蛋白结合蛋白基因(VIGILIN)是否参与肝癌细胞在细胞周期中印记基因H19和胰岛素样生长因子2(IGF2)表达的调控。方法通过流式细胞术检测人肝癌细胞HepG2细胞周期选择周期点,采用RT-PCR、RNA干扰、实时荧光定量RT-PCR检测各周期点VIGILIN、H19、IGF2基因表达。结果①HepG2细胞周期约为20h;其中0～9h、20～28h约为S期,9～20h、28～39h约为G2/M、G1期,并选定6h、20h、43h、60h,分别代表S期中期、G1～S期、S期中期和G1期末;②细胞周期同步化后加入血清,刺激VIGILIN转录,上调VIGILIN的表达,从G2/M至G1期,逐渐增加,G1期末达高峰,S期逐渐减少;与之相反,H19的表达,在S期逐渐增加,在G2/MG1期逐渐减少,在S期中期达到高峰。而IGF2的表达也增加但没有明显的周期性。H19与VIGILIN mRNA表达呈负相关(r=-0.6941,P<0.05)。③用VIGILIN shRNA(pSIREN-VIG shRNA)重组载体转染HepG2细胞48h后,相对于3个对照组(未转染组,脂质体转染组和转染pSIREN-GFP shRNA组),实验组VIGILIN mRNA的表达受到明显抑制,此时,IGF2mRNA表达增加30.13%,H19mRNA表达减少12.08%。结论VIGILIN和H19 mRNA表达与细胞周期有关;VIGILIN参与调控H19、IGF2印记基因的表达。
- 葛亚俊谢晓砚杨博柴新娟张迎春覃扬
- 关键词：MRNA表达细胞周期
- 中药成分CDP对乳腺癌细胞P16,E-CADHERIN去甲基化作用的研究被引量：6
- 2009年
- 目的探讨中药成分CDP对乳腺癌细胞系T47D和MDA-MB-435的抑癌基因P16和E-CADHERIN启动子区CpG岛的去甲基化作用。方法培养人乳腺癌细胞系T47D和MDA-MB-435,分别用不同剂量、同一剂量不同时间的CDP和5-azacytidine(5-aza-C)处理细胞;用甲基化特异性PCR(MSP)和半定量RT-PCR,检测细胞中P16和E-CADHERIN基因的甲基化改变和RNA表达恢复情况。结果①在25、50、75和100μmol/L剂量的CDP持续作用6d后,T47D细胞P16基因启动子区CpG岛甲基化特异性条带减弱,在100μmol/L剂量时消失,在4个剂量CDP作用下,非甲基化特异性条带均重新出现;在75和100μmol/L浓度作用下时,T47D细胞中出现P16基因重新表达;②在50μmol/LCDP作用144h后,T47DP16基因启动子区CpG岛甲基化特异性条带仍存在;非甲基化特异性条带24h出现并持续到144h;在药物作用144h时,P16出现表达。③在MDA-MB-435细胞中,用不同剂量CDP处理或同一剂量CDP处理不同时间后,均未观察到E-CADHERIN非甲基化条带的出现,RT-PCR也未检测到E-CADHERIN基因的表达。结论在T47D细胞中,中药成分CDP可以剂量、时间依赖的形式逆转高甲基化的P16基因,而对MDA-MB-435细胞中高甲基化的E-CADHERIN基因无效,提示CDP药物存在靶分子反应多样性。
- 柴新娟栾菊杨文理张迎春葛亚俊覃扬
- 关键词：P16E-CADHERIN去甲基化T47D
- 人CTCF N端融合蛋白的表达、抗体制备及鉴定被引量：1
- 2010年
- 为研究CTCF的功能,进一步探索肿瘤的发病机制,我们成功制备了人转录因子CTCF N端融合蛋白多克隆抗体,并初步用于肿瘤细胞CTCF表达状态的分析。采用已构建的表达质粒PGEX-4T-2-CTCF-N,经IPTG诱导表达GST-CTCF N融合蛋白,亲和层析纯化GST-CTCF N融合蛋白,免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。并通过Western blot,对肿瘤细胞和组织CTCF蛋白表达状态进行初步分析。本实验成功在大肠杆菌BL21中诱导表达了GST-CTCF N融合蛋白,经亲和层析纯化获得了纯化的融合蛋白。免疫新西兰大白兔获得了较高生物活性和特异性的多克隆抗体,Western blot证实此多克隆抗体能够特异性识别HepG2、HeLa、MCF-7癌细胞及组织的内源性CTCF蛋白,为今后从蛋白质水平研究CTCF基因表达调控研究打下了基础。
- 张迎春蒋磊魏玲柴新娟葛亚俊覃扬
- 关键词：CTCF多克隆抗体WESTERNBLOT肿瘤细胞表达
- 人VIGILIN基因分段克隆及表达
- 2015年
- 目的探讨人高密度脂蛋白结合蛋白(HDLBP)-VIGILIN蛋白与其他蛋白质相互作用的机制。方法根据VIGILIN基因全长编码区的结构域,将VIGILIN基因全长编码区分为N端、KH1-7、KH8-12、KH13-14、C端5段,以pDsred2-N1/VIGILIN为模板分别扩增5个片段及全长cDNA后克隆至pGEX 5X3原核表达载体,测序,然后将鉴定后的重组质粒转化到表达宿主菌E.coli BL21中进行诱导表达GST-VIGILIN融合蛋白,并用SDSPAGE电泳及Western blot检测蛋白表达结果。结果成功扩增了人VIGILIN基因编码区分段片段,并且构建到原核表达载体中,经酶切、测序鉴定证实序列完全正确,重组载体构建成功,并且在pGEX原核表达系统中诱导表达GST-VIGILIN融合蛋白,经SDS-PAGE电泳及Western blot检测初步证实表达成功。结论本实验首次根据VIGILIN蛋白不同的结构域成功构建了GST-VIGILIN分段克隆原核表达载体,并且对融合蛋白表达条件进行了优化,成功表达了GST融合蛋白。
- 俞小琴魏玲刘秋英黄元赵荣策覃扬
- 关键词：结构域原核表达系统
- Vigilin在多种细胞系以及人原发性肝细胞肝癌中的表达研究
- 2011年
- 目的探讨Vigilin基因在肿瘤细胞系、正常细胞系以及人原发性肝细胞肝癌组织中的表达及其与肝癌发生的关系。方法提取肝癌细胞系、宫颈癌细胞系和正常细胞系总蛋白,采用免疫印迹方法对Vigilin的表达进行半定量检测。收集59例人原发性肝细胞肝癌标本,进行Vigilin的免疫组织化学染色。结果 Vigilin在所检测的细胞系中,除外周血淋巴细胞外的细胞系均有表达,其中肝癌细胞系中Vigilin的表达均强于正常细胞系(P<0.05)。肝癌组织、癌旁组织和远癌组织中大部分细胞均表达Vigilin,其表达量分别为0.2226±0.054、0.2060±0.056和0.1820±0.038(P<0.001)。肿瘤组织Vigilin高表达的比例为54%,而癌旁和远癌组织高表达的比例分别为32%和6%。Vigilin在肿瘤组织中的表达状态和临床参数间均无明显关系。结论 Vigilin高表达与细胞增殖有关,其可能参与人原发性肝细胞肝癌的发生或发展。
- 段树旺魏玲杨文理陈克霏黄文庆覃扬
- 关键词：细胞增殖
- pCS-CG-DsRed2-vigilin重组载体的构建及vigilin重组慢病毒包装
- 2014年
- 目的构建pCS-CG-DsRed2-vigilin慢病毒重组载体,以及包装pCS-CG-DsRed2-vigilin重组慢病毒。方法用NheⅠ、NotⅠ将目的片段红色荧光蛋白基因DsRed2从pDsRed2-N1中切下,连入pcDNA3.1(-)上,再用Kpn1从pcDNA3.1(-)-DsRed2中切下DsRed2片段插入pCS-CG-vigilin中。用相应的内切酶鉴定,阳性克隆送测序鉴定。采用三质粒系统包装慢病毒并分别感染HEK293T和HepG2细胞。结果电泳显示,构建的pCS-CG-DsRed2-vigilin用KpnⅠ和SacⅡ分别单酶切切下800bp和600bp的插入片段,阳性克隆质粒测序结果与pDsRed2-N1中DsRed2序列一致;HEK293T和HepG2细胞感染后均能观察到较强的红色荧光。结论带有红色荧光基因的pCS-CG-DsRed2-vigilin重组载体构建成功;成功包装出带红色荧光标签的vigilin重组慢病毒,且该病毒具有较高的感染效率。
- 沈文燕李冉覃扬杨文理刘秋英魏玲俞小琴
- 关键词：重组慢病毒
- 不同固定方法对细胞免疫荧光染色结果的影响被引量：7
- 2013年
- 目的比较不同的固定方法对细胞内胞浆蛋白Vigilin和核蛋白CTCF的免疫荧光染色结果的影响。方法在免疫染色前,分别采用四种方法对HepG2细胞进行固定及通透:①纯甲醇-20℃处理8min后,再用80%丙酮-20℃处理1min。②甲醇:丙酮的1∶1混合溶剂-20℃处理10min。③在方案2的基础上,再用0.1%Triton-X-100冰上通透10min。④4%多聚甲醛室温固定10min后,用0.1%Triton-X-100冰上通透10min。结果采用方案①、②、③、④得到的胞浆蛋白vigilin在细胞内的大致分布无明显差异,但用方案④处理后,染色效果更为清晰而能更好地观察到细胞的细微结构;另外,采用方案①和方案②处理细胞后,对核蛋白CTCF进行免疫染色,可见CTCF分布于胞浆;方案③中,在纯甲醇固定后,若用0.1%Triton-X-100通透,则CTCF显示主要分布于细胞核内,胞质内亦有阳性染色;方案④的通透条件下,CTCF特异性分布于细胞核,胞质内几乎无阳性染色。结论不同的固定及通透方法对免疫染色的结果影响很大,应针对抗原特点,采用适宜的固定方法,以得到正确的实验结果。
- 李冉杨文理覃扬魏玲沈文燕刘秋英俞小琴
- 关键词：免疫荧光核蛋白
