国家自然科学基金(31272557)
- 作品数：8 被引量：15H指数：3
- 相关作者：黄兵董辉赵其平韩红玉朱顺海更多>>
- 相关机构：中国农业科学院上海兽医研究所上海师范大学云南农业大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金项目中央级公益性科研院所基本科研业务费专项更多>>
- 相关领域：农业科学更多>>
- 寄生虫潜在药物靶标—乳酸脱氢酶
- 2015年
- 寄生虫是包括原虫、吸虫、绦虫、线虫、棘头虫等在内的一大类生物的总称,可引起重要的人畜寄生虫病。抗寄生虫药物的长期使用甚至是滥用使得寄生虫对现有药物产生了明显的抗药性,急需开发新型药物以有效控制寄生虫感染。乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)是糖酵解途径的末端酶,在还原型辅酶Ⅰ(NADH)和氧化型辅酶Ⅰ(NAD+)的辅助下,催化丙酮酸与乳酸之间的可逆反应,释放能量供寄生虫所需。本文针对抗寄生虫药物靶标的鉴定方法以及寄生虫LDH作为潜在药物靶标的研究进展进行了综述,对阐明药物的分子作用机理及研发新药具有重要的理论意义。
- 李莎董辉黄兵
- 关键词：寄生虫抗寄生虫药物药物靶标乳酸脱氢酶
- GST-pulldown联合质谱筛选EtAMA1相互作用蛋白
- 顶复器门原虫是一群专性胞内寄生性原虫,目前研究认为,该类原虫入侵宿主细胞主要包括三个阶段,第一个阶段是虫体顶端与宿主细胞膜之间相互接触后的'滑行'运动;第二个阶段是运动接环的形成,即虫体顶端与宿主细胞形成的紧密接触点然后...
- 崔晓霞黄兵赵其平韩红玉朱顺海徐帅兵谢雨翔唐敏杨志远董辉
- 关键词：球虫相互作用蛋白
- 文献传递
- 地克珠利对柔嫩艾美耳球虫乳酸脱氢酶特性影响研究
- 地克珠利是一种三嗪类化合物,具有高效、低毒、广谱的抗球虫效力,但至今其作用机制尚不清楚.研究表明,柔嫩艾美耳球虫地克珠利耐药株LDH(rEtLDH)与敏感株LDH(sEtLDH)之间同工酶谱存在明显差异,提示EtLDH与...
- 李莎董辉赵其平韩红玉朱顺海翟颀梁思婷杨斯涵黄兵
- 关键词：球虫地克珠利乳酸脱氢酶耐药性
- 寄生虫乳酸脱氢酶研究进展被引量：4
- 2014年
- 大多数体内寄生虫的生存必须依赖糖酵解途径将葡萄糖代谢为乳酸以提供能量。乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)是糖酵解途径的末端酶,催化丙酮酸还原为乳酸及乳酸氧化为丙酮酸的可逆反应,与寄生虫生存密切相关。研究表明,各种寄生虫LDH在理化性质和分子结构方面均有独特的特性,是良好的诊断分子和潜在的药物作用靶标。对寄生虫LDH功能的研究,对于促进寄生虫病诊断、疫苗研究以及新抗虫药物的研发具有重要意义。本文对国内外寄生虫LDH的研究现状进行了综述。
- 王艳歌董辉黄兵
- 关键词：乳酸脱氢酶寄生虫药物靶标疫苗
- 柔嫩艾美耳球虫乳酸脱氢酶真核表达质粒的构建与鉴定被引量：4
- 2014年
- 为构建柔嫩艾美耳球虫乳酸脱氢酶(Eimeria tenella Lactate dehydrogenase,EtLDH)的真核表达质粒,分别以柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子和鸡脾脏cDNA为模板,PCR扩增出EtLDH和鸡IFN-γ基因,PCR产物经酶切回收目的片段后与相应酶切的真核表达载体pCAGGS连接,构建了真核表达质粒pCAGGS-EtLDH和pCAGGS-EtLDH-IFN-γ。所构建的真核表达质粒经酶切和测序鉴定为正确后转染293T细胞进行表达,分别用Western blot和间接免疫荧光鉴定EtLDH基因的表达情况。Western blot结果可见大小约为37 kDa的目的蛋白条带,间接免疫荧光可以检测到特异性红色荧光。结果表明成功构建了EtLDH的真核重组表达质粒pCAGGS-EtLDH和pCAGGS-EtLDH-IFN-γ,并能在真核细胞中表达,为深入研究EtLDH的生物学功能和球虫DNA疫苗的研制奠定了基础。
- 王艳歌董辉韩红玉赵其平朱顺海李榴佳吴有陵黄兵
- 关键词：柔嫩艾美耳球虫乳酸脱氢酶IFN-Γ基因293T细胞真核表达
- 柔嫩艾美耳球虫顶膜抗原-1潜在子孢子互作蛋白的筛选被引量：3
- 2017年
- 为了筛选与柔嫩艾美耳球虫顶膜抗原-1(Eimeria tenella apical membrance antigen 1,EtAMA1)存在互作的子孢子蛋白,以柔嫩艾美耳球虫子孢子c DNA为模板,PCR扩增EtAMA1基因胞外区,将扩增产物与p GEX-6P-1连接,构建原核表达质粒p GEX-6P-1-EtAMA1,表达、纯化重组蛋白EtAMA1-GST。纯化的重组蛋白经Western blot验证,结果显示在75 k Da处有单一的目的条带,证实了所获得的蛋白为EtAMA1-GST融合蛋白。将EtAMA1-GST蛋白、GST蛋白和PBS分别与谷胱甘肽琼脂糖珠孵育后,再分别与子孢子裂解物共孵育,洗脱液经SDS-PAGE分析后,结果显示三者之间的条带明显不同。将差异条带切下进行质谱分析,对获得的蛋白质肽段与Uniprot中鸡球虫蛋白质数据库进行Blast比对,初步获得了10个与EtAMA1存在潜在互作的柔嫩艾美耳球虫子孢子蛋白,包括微线体蛋白、糖酵解酶类、肌动蛋白相关因子以及一些保守蛋白等,他们广泛参与了虫体的入侵、发育、能量代谢等生物学过程。研究结果为进一步阐明EtAMA1在球虫入侵宿主细胞中发挥重要作用的分子机制奠定了基础。
- 崔晓霞黄兵赵其平韩红玉朱顺海徐帅兵谢雨翔唐敏杨志远董辉
- 关键词：柔嫩艾美耳球虫GST相互作用蛋白
- 柔嫩艾美耳球虫乳酸脱氢酶单克隆抗体的制备及其在蛋白定位中的应用被引量：2
- 2015年
- 为了制备柔嫩艾美耳球虫乳酸脱氢酶(Eimeria tenella lactate dehydrogenase,Et LDH)单克隆抗体,用大肠杆菌表达的重组Et LDH可溶性蛋白免疫BALB/c小鼠,经5次免疫后取脾脏制备免疫脾细胞,与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,用间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞,经3次亚克隆后获得2株能稳定分泌Et LDH单克隆抗体的杂交瘤细胞株2F7和2H4,抗体亚类鉴定均为Ig G1,腹水效价分别为1:8000和1:64 000。Western blot结果显示2F7抗体能识别柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子中大小约为35 k Da的天然蛋白。利用该单抗对Et LDH在柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子中的分布进行了定位,结果显示该蛋白主要分布于裂殖子的细胞质,表明成功地制备了Et LDH单克隆抗体,为深入研究Et LDH的功能和特性奠定了基础。
- 李莎梁思婷赵其平韩红玉朱顺海翟颀杨斯涵黄兵董辉
- 关键词：柔嫩艾美耳球虫乳酸脱氢酶单克隆抗体免疫荧光定位
- 柔嫩艾美耳球虫沉默信息调节因子2真核表达质粒的构建及在细胞中的表达被引量：4
- 2015年
- 为构建柔嫩艾美耳球虫沉默信息调节因子2(Eimeria tenella silent information regulator 2,Et SIR2)的真核表达质粒,以柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子c DNA为模板,PCR扩增出Et SIR2基因,PCR产物经酶切回收纯化目的片段后与经相应酶切的真核表达载体p CAGGs连接。连接产物经PCR和酶切鉴定,再经测序鉴定正确后,分别转染DF-1细胞和BHK细胞进行表达,用Western blot和间接免疫荧光鉴定Et SIR2基因的表达情况。结果表明:成功扩增了Et SIR2基因,长度为909 bp;Western blot可见大小约为37 k Da的表达蛋白条带;间接免疫荧光可以检测到特异性绿色荧光,表明成功构建了Et SIR2的真核表达质粒p CAGGsEt SIR2,并能在哺乳动物细胞和禽类细胞中表达。该研究结果为深入研究Et SIR2的生物学特性和球虫DNA疫苗的研制打下了基础。
- 杨斯涵赵其平韩红玉朱顺海李莎翟颀梁思婷杨亮宇黄兵董辉
- 关键词：柔嫩艾美耳球虫BHK细胞真核表达
- 柔嫩艾美耳球虫丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶真核表达质粒的构建及其在DF-1细胞中的表达被引量：3
- 2016年
- 为了构建柔嫩艾美耳球虫丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Eimeria tenella serine/threonine protein kinase,Et STK)基因的真核表达重组质粒,并实现在DF-1细胞中的表达,以柔嫩艾美耳球虫子孢子c DNA为模板,PCR扩增Et STK基因,将扩展产物与真核表达质粒pc DNA3.1-flag连接,构建重组真核表达质粒pc DNA3.1-flag-Et STK,测序鉴定正确后,转染DF-1细胞进行表达,利用Western blot和间接免疫荧光(indirect immunofl uorescene assay,IFA)对其表达情况进行鉴定。结果表明重组质粒pc DNA3.1-flag-Et STK构建成功。Western blot显示在54 k Da处出现条带;IFA检测到特异性的绿色荧光,表明构建的重组质粒pc DNA3.1-fl ag-Et STK成功地在DF-1中实现了表达。本研究结果为深入了解柔嫩艾美耳球虫丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的功能及球虫核酸疫苗提供了基础。
- 朱雪龙黄兵韩红玉赵其平朱顺海李聪门启斐王自文夏伟丽董辉
- 关键词：柔嫩艾美耳球虫真核表达
- 柔嫩艾美耳球虫子孢子酵母双杂交cDNA文库的构建
- 2016年
- 为了筛选柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵相关的蛋白,利用酵母双杂交体系构建了柔嫩艾美耳球虫子孢子酵母双杂交cDNA文库。提取纯化的子孢子总RNA,经MMLV-RT反转录合成cDNA第一链后,利用LD-PCR扩增合成双链cDNA（ds cDNA）,dscDNA经纯化柱CHROMA SPINT＋TE-400 Columns纯化剔除小于200 bp的片段。将纯化后dscDNA、pGADT7-Rec及Carrier DNA共转化到已经制备好的酵母感受态细胞Y187中,dscDNA与pGADT7-Rec以同源重组的方式在细胞内进行连接,经过缺陷性培养基（SD/-Leu）的筛选得到酵母双杂交cDNA文库。结果显示,构建的柔嫩艾美耳球虫子孢子酵母双杂交cDNA文库的转化率为4.33×10^5/μg pGADT7-Rec,文库滴度为3.62×10^7 cfu/m L。随机挑取32个单克隆进行PCR检测,插入片段大小为200~2000bp,重组率为93.75%,并以该文库作为模板,用柔嫩艾美耳球虫5对特异性引物进行PCR扩增,获得了这5个基因片段。结果表明成功构建了柔嫩艾美耳球虫子孢子酵母双杂交cDNA文库,为进一步筛选和研究球虫入侵互作蛋白奠定了基础。
- 徐帅兵黄兵赵其平董辉朱顺海崔晓霞谢雨翔唐敏杨志远韩红玉
- 关键词：柔嫩艾美耳球虫子孢子同源重组
