国家自然科学基金(31272568)
- 作品数：9 被引量：28H指数：3
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- 鸡源志贺菌IpaC基因表达载体的构建及其在毕赤酵母中的表达
- 2016年
- 为使IpaC基因表达产物保持天然的生物学活性,实现在酵母表达系统中高效表达,本研究在不改变IpaC蛋白氨基酸序列的情况下,根据酵母密码子偏爱性优化合成IpaC#基因,分别构建真核表达载体pGAPZαA-IpaC和pGAPZαA-IpaC#,然后将线性化重组质粒电转化至毕赤酵母X-33中,对阳性转化子用SDS-PAGE及Westernblot检测其表达产物。结果表明,经SDS-PAGE及Westernblot检测,仅在pGAPZαA-IpaC#/X-33重组菌表达产物菌体沉淀中检测到大小为70ku的目的蛋白,实现了鸡源志贺菌IpaC#基因在毕赤酵母中的胞内表达,从而验证毕赤酵母表达系统与外源基因序列的相关性,为进一步提高鸡源志贺菌IpaC基因在毕赤酵母中的高效表达提供科学依据,对研究该病的发病机制具有重要意义。
- 韩志霞马金玉王雪云蒋大伟刘芳许兰菊李克宇
- 关键词：毕赤酵母真核表达
- 利用免疫沉淀法对鸡源志贺菌IpaC蛋白受体候选蛋白的初步筛选被引量：1
- 2016年
- 为筛选鸡源志贺菌IpaC蛋白的受体。利用生物素标记试剂盒标记IpaC蛋白，分离培养原代鸡肠上皮细胞和。利用ProteoExtract？天然膜蛋白提取试剂盒提取鸡肠上皮细胞的膜蛋白；应用免疫沉淀、免疫磁珠法分离富集与IpaC蛋白结合的蛋白质；利用SDS-PAGE电泳检测和Western blot鉴定。结果获得了与IpaC蛋白特异性结合的大约在34000～55000之间的蛋白条带。筛选得到的SDS-PAGE蛋白条带进行LC—MS／MS测序鉴定和生物信息学分析。初步将annexin A2，37000 Laminin receptor precursor，LIM and SH3 proteinl，ras—related protein Rab-43作为IpaC蛋白受体的候选蛋白。为研究志贺菌在鸡体内的致病机制奠定基础，而且可以为评估鸡源志贺菌在公共卫生方面的重要性提供参考依据。
- 韩志霞刘芳蒋大伟许兰菊孔江南李克宇
- 关键词：免疫沉淀受体
- 河南省部分地区鸡大肠杆菌的分离鉴定及耐药性研究被引量：17
- 2015年
- 为了解河南省鸡场大肠杆菌的流行情况,对采自周口、商丘、安阳等6个地区的腹泻鸡病料进行病原的细菌学检验和药敏试验,经分离培养、形态染色镜检、生化试验、血清学试验和动物试验,共分离鉴定出11株鸡大肠杆菌,有5种血清型,分别为O14、O15、O24、O143、O157。动物试验结果表明,分离鉴定出的这5种血清型大肠杆菌均有致病性,且毒力不同,其中从周口、开封、鹤壁分离的菌株毒力强,死亡率均为100%。药敏试验结果表明,大部分菌株对链霉素、阿莫西林/棒酸敏感,对头孢唑啉、强力霉素、氨苄西林、磷霉素、呋喃妥因均存在不同程度的耐药现象,其中对强力霉素、氨苄西林、头孢唑啉严重耐药。
- 张彬韩志霞马金玉王雪云许兰菊李克宇
- 关键词：大肠杆菌耐药性
- 双重溶菌质粒制备鸡痢疾志贺菌菌壳的研究
- 通过将两种不同的重组溶菌质粒转化至鸡痢疾志贺菌中,构建含有双重溶菌质粒的志贺菌重组菌株,以提高该菌菌壳制备的裂解率和稳定性,并对其特性进行研究。用重组溶菌质粒pBV220::E和pBBRIMCS-E共同转化到鸡痢疾志贺菌...
- 蒋大伟刘军孙洋祝令伟冯书章许兰菊
- 关键词：志贺菌疫苗
- 文献传递
- 双重溶菌质粒制备鸡痢疾志贺菌菌壳的研究
- 2013年
- 通过将2种不同的重组溶菌质粒转化至鸡痢疾志贺菌中,构建含有双重溶菌质粒的志贺菌重组菌株,以提高该菌菌壳制备的裂解率和稳定性,并对其特性进行研究。用重组溶菌质粒pBV220::E和pBBRIMCS-E共同转化到鸡痢疾志贺菌,构建志贺菌重组菌株Sd(pBV220::E/pBBRI MCS-E),重组菌株于28℃培养至D600值为0.5时升至42℃继续培养,间隔30min检测菌液D600值,进行重组菌株的溶菌裂解动力学比较试验,绘制裂解曲线图并计算出裂解率,制备菌壳并对其形态进行电镜观察。重组菌株Sd(pBV220::E/pBBRIMCS-E)经42℃诱导后可形成菌壳且保留了基本的细胞形态,裂解率达到了99.999 9%。本研究成功制备出鸡痢疾志贺菌菌壳,为研究利用该菌菌壳预防鸡痢疾志贺菌病的可行性奠定了基础。
- 蒋大伟刘军张瑞安夏力亮孙洋祝令伟冯书章许兰菊
- 关键词：志贺菌疫苗
- 鸡源志贺氏菌IpaC基因新型表达载体构建及其在毕赤酵母中的表达
- 2016年
- 为使鸡源志贺氏菌IpaC蛋白保持天然的生物学活性,在毕赤酵母表达系统中实现分泌表达,进一步研究IpaC蛋白的生物学功能,本研究在不改变IpaC蛋白氨基酸序列的情况下,根据酵母密码子偏爱性优化合成IpaC#基因,利用真核表达载体p GAPZA和8种真核信号肽,分别构建真核表达载体pGAPZA-Inu/Inv/Kil/Lys/Mat/Amy/Glu/Ser-IpaC#,然后将线性化的重组质粒电转化至毕赤酵母X-33中,对阳性转化子进行表达,并用SDS-PAGE及Western-blot检测其表达产物。结果表明:在8种重组菌表达产物的菌体沉淀中检测到大小约为60 ku的目的蛋白。说明鸡源志贺氏菌IpaC基因成功实现了在毕赤酵母的胞内表达。
- 马金玉韩志霞蒋大伟王亚宾许兰菊苗银萍孔江南
- 关键词：毕赤酵母
- 鸡源志贺菌IpaC基因的克隆及原核表达被引量：3
- 2013年
- 应用PCR方法从ZMD-01株鸡源志贺菌中扩增IpaC目的基因,并将IpaC基因克隆至载体pET32α（＋）中,构建原核表达载体pET32α（＋）-IpaC,然后转化至大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达并优化表达条件,最后进行目的蛋白的可溶性鉴定及Western-blot鉴定。结果显示,扩增出大小为1 092bp的IpaC基因,与10株人源志贺菌参考株的核苷酸序列同源性为97.3%~99.8%、氨基酸序列同源性为96.4%~99.7%;进化树结果显示,与参考株AL391753相似性较大,它们在同一个分支上;SDS-PAGE结果显示,重组表达菌在约63 000处出现条带,最佳表达条件确定为诱导前培养3h、IPTG终浓度为1.0mmol/L、加入IPTG诱导4h;蛋白既存在上清中也存在包涵体中,上清蛋白纯化后纯度可达90%以上;Western-blot分析显示,融合蛋白有反应原性。以上结果表明,鸡源志贺菌IpaC基因与人源志贺菌有较高的同源性;成功表达了IpaC蛋白,为今后研究鸡源志贺菌IpaC蛋白参与的致病机制奠定基础。
- 苗银萍蒋大伟许兰菊王川庆尤晓楠李克宇
- 关键词：克隆
- 鸡源志贺菌IpaC基因变构体重组酵母表达载体的构建及初步表达被引量：1
- 2015年
- 为使IpaC基因表达产物保持天然的生物学活性,实现在酵母表达系统中高效表达,本研究首先采用反向PCR将IpaC基因358～360位和361～363位酵母菌低频密码子突变为偏嗜性密码子,并进一步构建了克隆载体pMD18-T-IpaC＊和酵母表达载体pPICZαA-IpaC＊,然后将线性化重组质粒pPICZαA-IpaC＊电转化至毕赤酵母X-33中,对阳性转化子进行诱导表达,并用SDS-PAGE检测其表达产物。结果表明SDS-PAGE在大约63 000处检测出目的条带,实现了鸡源志贺菌IpaC基因在毕赤酵母中的初步表达。这为进一步研究IpaC生物学功能奠定了基础。
- 李克宇刘一尘蒋大伟张春杰许兰菊张彬王雪云马金玉韩志霞
- 关键词：毕赤酵母
- 鸡源志贺菌IpaC蛋白单抗制备及其受体的初步鉴定
- 2016年
- 为制备特异性的鸡源志贺菌IpaC蛋白单克隆抗体和鉴定其受体,以纯化的重组鸡源志贺菌IpaC蛋白制备多克隆抗体,Western blot和间接ELISA分析表明重组IpaC蛋白具有很好的免疫反应原性。将纯化的IpaC蛋白免疫BALB/c小鼠,通过淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体。经过杂交瘤细胞阳性孔的筛选、单克隆抗体效价测定、单克隆抗体亚型鉴定、单克隆抗体Western blot鉴定后,获得1株杂交瘤阳性细胞5A12B5。同时,通过鸡胚肠组织提取总蛋白,利用铺覆蛋白印迹技术,初步测定IpaC蛋白受体相对分子质量约为55 000。试验为IpaC蛋白检测和该蛋白与鸡肠上皮细胞之间的相互作用研究奠定基础,同时也为评估鸡源志贺菌在公共卫生等方面的重要性提供参考依据。
- 蒋大伟张彬马金玉韩志霞王亚宾许兰菊苗银萍
- 关键词：单克隆抗体受体
- 鸡肠上皮细胞原代培养与鉴定被引量：7
- 2015年
- 为了探讨鸡肠上皮细胞体外分离培养方法,进一步研究鸡源志贺菌Ipa C毒力蛋白在鸡肠上皮细胞上的受体蛋白分子,试验分别无菌取14,16,18日龄鸡胚肠组织,用300 U/m LⅪ型胶原酶和0.1 mg/m LⅠ型中性蛋白酶混合搅拌消化25 min,用壁差法纯化鸡肠上皮细胞,贴壁时间差为3 h,分别种植于20%FBS包被过的和未包被过的一次性塑料细胞培养瓶中,在倒置显微镜下观察细胞生长状态,透射电镜下对培养细胞进行鉴定。结果表明:采用16日龄鸡胚肠组织用Ⅺ型胶原酶和Ⅰ型中性蛋白酶联合消化25 min,可获得较多的肠隐窝单位,肠上皮细胞在20%FBS包被过的一次性细胞培养瓶中贴壁效果良好,细胞生长状态良好;透射电镜下可见鸡肠上皮细胞的微绒毛,鉴定为鸡肠上皮细胞。
- 王雪云刘芳蒋大伟韩志霞马金玉李克宇张彬许兰菊
- 关键词：鸡胚
