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基于Perl脚本的大豆核苷酸序列高通量提取被引量：3: 2012年; 自从大豆全基因组测序完成和序列公布之后,阐明每个基因的生物学功能和调控网络成为当前的主要任务。基于Perl脚本开发了一套可以高通量、快速提取序列的程序,该程序可以批量提取大豆染色体某个区间的核苷酸序列并利用其他工具进行批量分析,还可用于某个基因在全基因组中的所有序列分析。本研究分别对大豆第4染色体Glyma04g00930.1～Glyma04g01740.1区间的基因序列和水通道蛋白基因家族成员TIP(液泡膜水通道蛋白)序列进行提取。结果发现:Glyma04g00930.1～Glyma04g01740.1区间共含有112个基因序列;大豆全基因组共有91个TIP基因,在20条染色体上均有分布,且在第12染色体上分布最多,多达10个,暗示该染色体可能对大豆的水分利用效率起着重要作用,基因所含内含子数为1～8个。序列提取所用的2个脚本程序可以从http://www.zlhyd.com/sxbi/soybean_strict.rar下载。; 张大勇王长彪易金鑫何晓兰马鸿翔

一个大豆GmXIP基因的克隆与表达分析被引量：1: 2012年; XIP(X Intrinsic Protein)亚家族蛋白作为水通道蛋白AQP(Aquaporin)的一个成员,最近在不同植物的基因组或表达序列标签(EST)文库中被鉴定出来。从前期通过Perl程序下载的大豆全基因组水通道蛋白序列中鉴定了一个大豆GmXIP基因,该基因含有一个长385 bp的内含子,且剪接方式是AG/AG,不同于植物普通的GT/AG剪接模式;与其他植物的XIP蛋白的氨基酸序列比对发现该蛋白也具有6个跨膜区,但MIP(Major Instrinsic Protein)家族蛋白保守的"NPA"基序突变为"NPI"和"SPA",暗示该蛋白负责的物质运输与其他植物XIP功能不同;半定量RT-PCR结果表明,该基因在叶和荚表达较弱外,在茎和叶部位的表达较强,而且随着植株的发育,在茎中的表达渐强,叶中则一直保持较高的表达,这表明该基因在营养物质的运输和供给过程中起着关键作用;同时根部组织在盐胁迫8 h时该基因表达达到了顶点,36 h时恢复到处理前的表达水平;利用发根农杆菌注射获得过表达GmXIP组合植株于干旱和盐胁迫处理后发现,该基因过表达后植株抵抗外界非生物胁迫的耐性大大降低,这暗示该基因的过表达可能增进了植物细胞的失水速度,导致植株死亡。这些研究为明确大豆XIP基因的结构和功能提供了理论支持和技术指导。; 张大勇易金鑫胡国民许玲袁玲玲徐照龙何晓兰黄益洪刘晓庆马鸿翔; 关键词：XIP 基因表达

大豆GmTIP1；1基因的克隆与表达分析被引量：1: 2013年; 利用RT-PCR方法从大豆根部组织获得Glyma03g34310.1开放阅读框(ORF)全长,经测序验证、Blast比对与同源性分析发现该序列编码的蛋白质与其他植物的TIP1;1蛋白具有较高的相似性,故命名为GmTIP1;1基因(GenBank登录号为AK285481),该基因ORF长753bp,编码1个包含250个氨基酸的蛋白,在ORF内部第381个核苷酸处含有1个94bp的内含子,符合↓GT--AG↓的剪接方式;系统进化树分析发现GmTIP1;1聚类到豆科植物分支,其他不同科的植物也有规律地聚到了不同分支,推测该蛋白氨基酸序列可以作为植物分类的依据之一;半定量RT-PCR结果表明该基因在大豆的不同器官、不同器官的不同发育阶段均具较高且同等的表达水平,暗示该基因在植物的整个发育进程中均具重要作用;在盐胁迫的不同时间点其表达量有下降的趋势,但仍然保持较高的表达水平;以pYES2为酵母表达载体,转化酿酒酵母INVSc1菌株,获得重组酵母INVSc1(pYES2-GmTIP1;1),转化菌株在盐胁迫下的存活率明显高于对照INVSc1(pYES2),而在干旱胁迫下则没有显著差异,表明该基因的表达能有效地提高酵母的耐盐性。; 张大勇胡国民易金鑫许玲Ali ZULFIQAR刘晓庆袁玲玲徐照龙何晓兰黄益洪马鸿翔; 关键词：酵母表达

一个大豆质子转运体GmMRP5的克隆与表达分析: 2013年; 为探明大豆中MRP蛋白基因的作用机理,从大豆材料中克隆到GmMRP5基因完整的编码序列,GmMRP5基因的开放阅读框(ORF)全长4 479 bp,编码1 492个氨基酸。序列比对与进化树分析表明:GmMRP5拥有13个推断的跨膜结构域(TMD)和典型的ABC转运蛋白保守结构域,系统进化树分析表明,GmMRP5与AtMRP5同缘关系最近,同属于ABC转运蛋白家族C亚家族;该基因是组成型表达基因,在大豆的根、茎、叶及荚中均有表达;经不同浓度脯氨酸和柠檬酸处理后,该基因在大豆根中的表达被强烈诱导并高效表达。Real-Time PCR结果表明,该基因在酸性缓冲液处理后表达量上调,推测其作为质子转运体参与大豆阴阳离子交换反应。; 许玲张大勇何晓兰徐照龙刘晓庆黄益洪马鸿翔易金鑫; 关键词：大豆 P5 基因克隆

Cd胁迫对大豆幼苗异黄酮合成关键酶基因表达的影响被引量：10: 2013年; 为了研究Cd胁迫对大豆异黄酮含量的影响,分析了Cd胁迫下大豆叶片和根系中异黄酮的积累情况,并通过定量PCR方法分析了根系在100μmol/L CdCl2处理不同时间下异黄酮合成途径中相关酶基因表达的变化。结果表明:大豆叶片中的异黄酮含量随着Cd处理浓度的增加而上升,根系中异黄酮含量在100μmol/L CdCl2处理5 d时显著上升;100μmol/L CdCl2处理24 h时,IFS2(异黄酮合酶)、PAL(苯丙氨酸裂解酶)、C4H(肉桂酸-4-羧化酶)、4CL(香豆酸辅酶A连接酶)、CHS(查尔酮合成酶)、CHI(查尔酮异构酶)和CHR(查尔酮还原酶)的表达量明显上升,并与根系中异黄酮含量的积累呈现一致的趋势,表明Cd胁迫下大豆可以通过提高异黄酮合成相关酶的表达来促进异黄酮的积累从而应对Cd胁迫。; 刘晓庆张大勇徐照龙许玲黄益洪何晓兰马鸿翔易金鑫; 关键词：大豆异黄酮镉

一个大豆ERF转录因子的克隆与表达分析被引量：2: 2011年; 利用RT-PCR方法从聚乙二醇(PEG)处理的大豆根部组织中克隆了1个大豆乙烯响应因子(ERF)基因,由于其位于大豆基因组第7染色体上,故命名为GmERF7,基因座为Glyma07g02930。序列分析结果表明:该基因含有1个237 bp长的内含子,开放阅读框(ORF)长585 bp,编码194个氨基酸,蛋白质分子量为2.199×104,理论等电点为7.06;通过氨基酸序列比对发现,该序列与其他物种ERF类蛋白质氨基酸序列有很高的相似性;聚类分析结果表明,GmERF7与苜蓿和蓖麻遗传距离最近,与拟南芥和葡萄遗传距离相对较远;半定量RT-PCR分析结果表明该基因主要在大豆叶和豆荚中表达,而且在外源20%PEG处理不同时间后,该基因的表达在根部组织和叶片组织都受到不同程度的诱导,暗示该基因可能对提高植物耐旱性具有一定作用;利用洋葱表皮细胞的亚细胞定位分析结果表明,该蛋白质位于细胞核内,当去除N端信号肽之后,该蛋白质分布于细胞膜部位,这表明该蛋白质在植物体内通过充当转录因子的作用来调节下游基因的表达;适时定量-PCR(Real-time PCR)分析结果证实,该基因在外源ABA处理后呈现先下调后上调又下降的趋势,表明该基因受ABA的诱导,可能参与了ABA依赖的植物抗逆信号转导途径。; 张大勇许玲易金鑫徐照龙何晓兰刘晓庆黄益洪ZULFIQAR A马鸿翔; 关键词：大豆

大豆高盐胁迫下根部组织酵母双杂交文库的构建与分析被引量：3: 2013年; 为了高效研究大豆耐非生物胁迫的分子调控网络,运用SMART(Switching Mechanism at 5'End of the RNA Transcript)与DSN(Duplex-Specific Nulease)相结合的技术构建了栽培大豆高盐胁迫下根部组织的酵母双杂交cDNA文库。提取高质量的总RNA,利用Oligo(dT)_(16)引物反转录合成cDNA后,经DSN处理,然后利用Advantage 2聚合酶进行长片段PCR扩增,电泳检测显示,产物均一,无高丰度条带,片段范围在0.75~5.00 kb;RT-PCR结果显示,GmActin基因在均一化后表达明显降低,表明均一化效果较好;最后通过SMART同源重组交换技术在酵母菌株Y18 7中构建了酵母双杂交所需的cDNA文库。文库质量检测结果表明:cDNA文库的总独立克隆数为5.61×10~6 cfu、文库滴度为3.4×10^(10)cfu/mL、重组率大于90%、插人片段长度为0.5~3.0 kb,主要集中在1.0 kb左右。; 何晓兰许玲徐照龙卫陪陪刘晓庆黄益洪张大勇; 关键词：大豆耐盐性

大豆ZF-HD蛋白家族的全基因组序列特征分析被引量：4: 2011年; 同源异形盒基因家族的同源域蛋白在植物、动物和真菌发育过程中作为转录因子起着重要的作用[1]。自从1993年Schinder首次发现植物同源结构域（PHD,Plant home-odomain）以来,还发现在拟南芥蛋白HAT3.1和HOXIA内含有一段富含半胱氨酸的保守序列,此序列与金属离子结合结构域（Metal-binding domains）非常相似[2]。; 张大勇王长彪易金鑫徐照龙何晓兰朱虹润马鸿翔; 关键词：基因结构染色体定位系统进化

大豆GmNAC8基因克隆与原核表达被引量：5: 2013年; 为了进一步明确GmNAC8基因的功能,设计带有Nde I和Xba I双酶切位点引物,从大豆根系cDNA中克隆到GmNAC8基因全长ORF(Open reading frame),编码蛋白质分子质量为37 000,理论等电点为6.43。将扩增片段克隆至原核表达载体pCZN1,构建重组质粒pCZN1-GmNAC8,经过酶切和PCR验证,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,0.2 mmol/L IPTG诱导后,经SDS-PAGE电泳检测获得了目的蛋白质,该蛋白质主要以包涵体的形式存在,通过镍柱子纯化获得纯化蛋白质,然后利用His标签蛋白质作为抗体进行Western-blot分析,证明所纯化蛋白质为目的蛋白质。; 刘晓庆徐照龙许玲黄益洪何晓兰张大勇马鸿翔; 关键词：基因克隆原核表达

GmCHS8和GmIFS2基因共同决定大豆中异黄酮的积累被引量：9: 2011年; 大豆异黄酮受多基因控制,采用传统育种方法提高大豆异黄酮含量比较困难。我们之前的研究表明,CHS8基因在异黄酮生物合成过程中发挥着重要作用,但CHS8基因过量表达并不能显著提高异黄酮含量。本研究利用Microarray技术,检测了高异黄酮品种RCATAngra(RCAT)和低异黄酮品种Harovinton(HVNT)的18362基因在种子发育过程中表达水平的变化以及大豆种子中异黄酮累积的趋势,利用RT-PCR证实CHS8和IFS2分别是CHSs和IFSs基因家族中的主要基因;证实CHS8是类苯基丙醇主路径中的主基因,并发现异黄酮支路中的IFS2基因在RCAT和HVNT品种中表达差异亦达到显著水平。进一步利用发根农杆菌转化系统,在大豆上分别过量表达CHS8、IFS2和CHS8+IFS2,前两者异黄酮含量较对照分别提高65.9%和34.4%,但增幅未达显著水平;而后者则提高了82.3%,增幅达极显著水平(P<0.0001),因而证实大豆中异黄酮的积累由CHS8和IFS2基因共同决定。; 易金鑫徐照龙王峻峰张大勇何晓兰ZULFIQAR Ali朱虹润马鸿翔SANGEETA Dhaubhadel; 关键词：大豆异黄酮

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江苏省自然科学基金(BK2010474)

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