福建省科技计划重点项目(2004Y018)
- 作品数：13 被引量：71H指数：7
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- 体外培养大鼠软骨细胞老化的机制初探
- 2008年
- 目的对体外传代培养的大鼠软骨细胞进行相关因子检测,初步探讨其复制性老化(传代培养出现的老化表现)的机制。方法对连续培养的第二、三、四代软骨细胞进行实验,采用免疫细胞化学检测p16、pRb、E2F、CyclinD、CDK4等因子表达水平,TRAP-ELISA检测端粒酶活性.观察软骨细胞老化过程中各因子的变化。结果随着细胞复制性老化p16、pRb、CyclinD表达水平显著上升(P<0.01),E2F、CDK4、端粒酶表达水平显著下降(P<0.01)。结论体外培养软骨细胞老化过程与p16、pRb、CyclinD表达增加,E2F、CDK4、端粒酶表达下降密切相关。
- 陈晓东林建华
- 关键词：软骨细胞
- 组织工程软骨对兔膝关节胫骨平台浅层全关节软骨缺损的修复作用被引量：7
- 2006年
- 目的探讨组织工程软骨对兔膝关节胫骨平台外侧髁浅层全关节软骨缺损的修复作用,并检测其修复组织的软骨类型。方法取2周龄乳兔软骨细胞体外培养传代至第3代后,与人胎盘Ⅰ型胶原蛋白海绵复合后植入成年兔的胫骨平台外侧髁完全软骨缺损区,并设立空白对照组,分别于术后4、12、24周取材,观察修复效果。运用天狼星红染色检测Ⅰ型胶原,Ⅱ型胶原单克隆抗体检测Ⅱ型胶原的表达。结果实验组术后4周缺损表面未见明显的新生软骨形成,组织学切片上少数几个呈上皮样生长的软骨细胞,苏木素-伊红(HE)染色胞浆呈深蓝色,周围软骨基质染色成浅蓝色；12周,缺损表面有少量的新生软骨形成,组织学切片上可见软骨细胞呈边缘不规则的,小蜂窝状结构,软骨细胞周围有软骨陷窝形成；24周,缺损表面的新生软骨较4、12周的新生软骨明显,表面光滑,且与周围组织结合紧密,但仍存在部分缺损尚未修复,组织学切片上可见软骨细胞呈边缘不规则的,多层细胞的蜂窝状结构,软骨细胞周围有软骨陷窝形成,并分泌甲苯胺蓝异染的软骨基质。而对照组则均未见明显的修复；随着术后时间的延长,Ⅰ型胶原的表达呈逐渐减弱的趋势,而Ⅱ型胶原的表达呈逐渐增强的趋势。结论该方法制成的组织工程软骨对兔胫骨平台外侧髁全层软骨缺损有修复作用,运用该方法不能完全修复兔胫骨平台外侧髁软骨完全缺损；形成的新生软骨为透明软骨样组织。
- 陈雷杨志明林建华李秀群
- 关键词：关节软骨缺损
- 鹿茸多肽对软骨表型化骨髓间充质干细胞凋亡的影响被引量：11
- 2006年
- 目的通过观察鹿茸多肽对白细胞介素1β(interleukin1β,IL-1β)诱导软骨表型化骨髓间充质干细胞(marrowmesenchymalstemcells,MSCs)凋亡的影响,以优化软骨组织工程的种子细胞。方法新西兰大白兔2只,抽取其骨髓;经密度梯度离心得到单核细胞,经体外分离、培养获得兔MSCs。用转化生长因子β1(transforminggrowthfactorβ1,TGF-β1)和碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)将其诱导分化软骨表型。将软骨表型化MSCs随机分成A组(空白对照组)5%胎牛血清的α-MEM培养液;B组(IL-1β组)5%胎牛血清的α-MEM培养液加入100ngIL-1β;C组(鹿茸多肽组)5%胎牛血清的α-MEM培养液加入10μg/ml鹿茸多肽作用3d后再加入100ngIL-1β;D组(TGF-β1组)5%胎牛血清的α-MEM培养液加入10ng/mlTGF-β1作用3d后再加入100ngIL-1β。分别于培养24、48和72h后取样,采用透射电镜观察细胞形态,AnnexinV法检测细胞凋亡率,RT-PCR技术分析Caspase-3mRNA表达水平,ELISA法检测Caspase-3蛋白酶活性。结果透射电镜观察B组24h后细胞核内染色质开始呈块状凝集,分布于核膜下,核膜不规则;48h后细胞核内染色质凝集加剧;72h后部分细胞内的核碎片凝集成凋亡小体。各时间点C、D组细胞结构改变相对滞后,且数量较少;A组细胞结构几乎无明显改变。各时间点B组MSCs凋亡率、Caspase-3mRNA表达及蛋白酶活性逐渐增高,与A组比较差异有统计学意义(P<0.01);C、D组与B组比较则逐渐下降,且差异有统计学意义(P<0.05)。结论Caspase-3参与MSCs凋亡,鹿茸多肽通过减少Caspase-3mRNA表达,并抑制其蛋白酶活性,阻止或逆转软骨表型化MSCs凋亡。
- 林建华修忠标吴朝阳王日雄
- 关键词：鹿茸多肽骨髓间充质干细胞凋亡
- 鹿茸多肽促进软骨细胞增殖机制的初步探讨被引量：3
- 2007年
- 目的探讨鹿茸多肽（PAP）促进软骨细胞增殖的机制。方法以12．5、25．0、50．0、100．0μg／mL不同浓度的PAP刺激软骨细胞，倒置相差显微镜观察软骨细胞生长情况，噻唑兰法（MTT）检测软骨细胞的生长增殖能力；以6、12、24、48μg／mL不同浓度酪氨酸受体激酶阻断剂Genis—tein作用于受PAP刺激的软骨细胞，用MTT和流式细胞仪观察Genistein对PAP作用的影响；免疫组化SABC法检测核增殖抗原cyclinA在PAP和PAP＋Genistein作用下的表达变化，RT—PCR法检测c-fosmRNA表达。结果PAP作用下c-fos mRNA与cyclinA表达增加，s期的细胞比例增高，从6．4％增加到35．2％；Genistein作用后PAP的促增殖作用受到明显的抑制，s期的细胞降到4％，c-fos mRNA与cyclinA表达亦减少；单纯用Genistein不影响软骨细胞生长。结论PAP可能通过酪氨酸受体蛋白激酶介导，作用下游的信号，引发立早基因c-fos表达，促进cyclinA的表达，引起更多的细胞进入有丝分裂期，从而促进软骨细胞增殖。
- 林建华邓凌霄吴朝阳陈雷
- 关键词：软骨增殖周期蛋白
- 鹿茸多肽对体外培养大鼠软骨细胞去分化现象的作用被引量：1
- 2009年
- 目的观察鹿茸多肽对大鼠关节软骨细胞体外传代培养中出现的去分化现象的作用。方法将第3代软骨细胞分为空白对照组、鹿茸多肽不同浓度组、硫酸氨基葡萄糖不同浓度组传代,使之进入第4代,同时以第2代软骨细胞为对照组,进行阿力新蓝染色法检测GAG(glycosaminoglycan)含量和结构,RT-PCR(reverese transcript-polymerase chain reaction)法检测Ⅱ型胶原、Aggrecan蛋白,对鹿茸多肽抗软骨细胞去分化进行分子生物学研究。结果鹿茸多肽对软骨细胞胞外基质中GAG、Ⅱ型胶原和Aggrecan蛋白表达有显著促进作用(P<0.01),其作用优于硫酸氨基葡萄糖。结论鹿茸多肽对体外培养的软骨细胞去分化现象有抑制作用,其作用优于硫酸氨基葡萄糖。
- 陈晓东林建华
- 关键词：软骨细胞去分化鹿茸多肽
- 鹿茸多肽对大鼠软骨细胞增殖的影响被引量：13
- 2008年
- 目的:探讨鹿茸多肽(PAP)对大鼠软骨细胞体外增殖的影响。方法:采用二次酶消化法获得大鼠关节软骨细胞进行传代培养并对第四代细胞进行药物干预,利用MTT比色、免疫组化检测增殖细胞核抗原(PCNA)、流式细胞术检测细胞周期等方法来检测各代次大鼠软骨细胞和药物干预后第四代软骨细胞的增殖情况。结果:大鼠软骨细胞随传代培养,MTT比色显示增殖呈下降趋势,免疫细胞化学检测PCNA表达减少,流式细胞术显示细胞增殖指数下降;PAP可以抑制这一趋势,促进传代培养的细胞增殖能力。结论:PAP对传代培养的大鼠软骨细胞的增殖能力有明显促进作用。
- 陈晓东林建华
- 关键词：鹿茸多肽软骨细胞增殖
- 硫酸氨基葡萄糖对大鼠软骨细胞增殖的影响被引量：1
- 2008年
- 目的:探讨硫酸氨基葡萄糖(GS)对大鼠软骨细胞体外增殖的影响。方法:采用二次酶消化法获得大鼠关节软骨细胞进行传代培养,并对第四代细胞进行药物干预,利用MTT比色、免疫组化检测增殖细胞核抗原(PCNA)、流式细胞术检测细胞周期等方法检测各代次大鼠软骨细胞和药物干预后第四代软骨细胞的增殖情况。结果:大鼠软骨细胞随传代培养,MTT比色显示增殖呈下降趋势,免疫细胞化学检测PCNA表达减少,流式细胞术显示细胞增殖指数下降;硫酸氨基葡萄糖可以抑制这一趋势,促进传代培养的细胞增殖能力。结论:GS对传代培养的大鼠软骨细胞的增殖能力有明显促进作用。
- 陈晓东林建华
- 关键词：硫酸氨基葡萄糖软骨细胞增殖
- 大鼠软骨细胞复制性老化的体外观察被引量：15
- 2007年
- 目的对体外培养大鼠软骨细胞复制性老化行为进行观察,为进一步研究组织工程软骨退变机制,以及用药物干预并逆转其退变提供实验参考。方法4周龄SD大鼠,体重185～200g,断颈处死,分离培养软骨细胞,采用组织化学法检测传代培养的P1、P2、P3及P4代软骨细胞老化相关β-半乳糖苷酶,透射电镜观察细胞结构,免疫细胞化学法检测增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)表达,阿力新蓝染色检测胞外基质硫酸糖胺多糖(sulfat-glycosaminoglycan,GAG)含量和分子结构,RT-PCR方法检测软骨细胞型胶原表达,流式细胞仪分析细胞周期及增殖指数(proliferative index,PI)。结果β-半乳糖苷酶检测:P1、P2代软骨细胞偶见阳性染色;P3代可见少数细胞阳性染色,与P1、P2代比较差异有统计学意义(P<0.01);P4代与P1～P3代比较,阳性染色显著增加,差异有统计学意义(P<0.01)。透射电静镜观察:P1、P2代细胞胞浆内细胞器较多,胞核及核仁清晰,无凋亡软骨细胞;P3代细胞核浆比较大,胞浆内细胞器减少,胶原网络结构模糊不清;P4代细胞核浆比例增大,核固缩。P4代细胞G0/G1期含量增加(83.8%),而P1、P2及P3代分别为79.1%,79.2%,80.8%。P4代细胞PI为16.2%,P1、P2、P3代PI分别为20.9%、20.8%、19.2%。PCNA表达、GAG含量、长链分子百分比、型胶原表达减少等指标P4代与前代比较差异均有统计学意义(P<0.01)。结论体外培养的大鼠软骨细胞P4代出现老化。
- 林建华陈晓东邓凌霄吴朝阳
- 关键词：软骨细胞细胞周期增殖表型
- 兔骨髓间充质干细胞体外培养的生物学特性及多潜能分化研究
- 2007年
- 目的:研究兔骨髓间充质干细胞体外培养的生物学特性,建立一种稳定的细胞分化体系。方法:取3月龄大耳白兔骨髓3ml^4ml,采用贴壁法获取骨髓间质干细胞,取2代细胞按1×104个/孔接种于24孔培养板内,绘制生长曲线。将传代2代细胞按3×103个.cm-2,接种于6孔板内,并加入条件培养液(地塞米松10-7mol.L-1,β-甘油磷酸钠10 ml.L-1,50 mg.L-1抗环血酸),ALP-钙化染色鉴定,将传代2代细胞按3×105个.cm-2接种于6孔板内,并加入条件培养液(TGF-β15 ng.ml-1,地塞米松10-7mol.L-1或多聚赖氨酸10μg.ml-1),阿新兰染色鉴定。结果:原代生长的细胞呈梭形,7d后形成多个集落,并逐渐溶合或片铺满瓶底,随着传代次数的增加,细胞增殖能力增强。骨髓间质干细胞在不同条件培养液下可向成骨细胞或软骨细胞分化,ALP-钙染色及阿新兰染色阳性。结论:在本培养体系下,骨髓间质干细胞生长良好,可分化为成骨细胞及软骨细胞,具有多向分化潜能。
- 李文革陈雷张杰吴朝阳
- 关键词：骨髓间质干细胞分化细胞培养
- 鹿茸多肽抗鼠软骨细胞老化的机制初探被引量：12
- 2008年
- 目的:对体外传代培养的大鼠软骨细胞进行鹿茸多肽干预对照实验,检测老化相关因子,初步探讨鹿茸多肽抗软骨细胞复制性老化的机制。方法:进行大鼠软骨细胞取材及传代培养,对第4代软骨细胞进行鹿茸多肽干预,并与第2、3、4代软骨细胞进行对照实验,采用免疫细胞化检测p16、pRb、E2F、CyclinD、CDK4等因子表达水平,TRAPELISA(telomerase repeat amplification protocol assayenzyme linked immunosorbent assay)检测端粒酶活性,进而考察鹿茸多肽对软骨细胞老化过程中各因子的影响。结果:随着细胞复制性老化p16、pRb、CyclinD表达显著上升(P<0.01),E2F、CDK4、端粒酶表达显著下降(P<0.01);鹿茸多肽干预后p16、pRb、CyclinD表达比第4代软骨细胞表达显著下降(P<0.01),E2F、CDK4、端粒酶表达显著上升(P<0.01)。结论:鹿茸多肽可以逆向影响老化相关调控因子的表达来实现其抗软骨细胞退变老化的作用。
- 陈晓东林建华
- 关键词：鹿茸多肽软骨细胞细胞衰老
