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人MxA基因的原核表达及其抗血清的制备被引量：1: 2013年; 本试验旨在利用大肠杆菌BL21(DE3)表达MxA融合蛋白pET32a(+)-MxA,制备兔抗人MxA抗血清。采用PCR技术获得MxA基因,然后将MxA基因重组到pET32a(+)载体中,筛选阳性克隆,转化大肠杆菌,IPTG诱导表达,用超声波裂解重组菌BL21(DE3)培养物,纯化蛋白质后免疫新西兰兔制备抗血清。SDS-PAGE分析结果显示,pET32a(+)-MxA融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中以包涵体形式高效表达;获得的抗血清经间接ELISA法检测效价为1∶6400;West-ern blotting检测结果显示,抗血清可与真核表达的MxA蛋白进行特异性结合。试验结果表明,在大肠杆菌中成功表达了pET32a(+)-MxA融合蛋白,制备了具有高度特异性的兔抗人MxA抗血清,这样为采用酶标法测定病毒患者全血细胞或由干扰素诱导的细胞产生的MxA蛋白质含量及临床诊断试剂盒的开发和应用打下了基础。; 辛婷婷王洪梅刘文浩孙涛王立群何洪彬; 关键词：MXA 原核表达抗血清

我国口蹄疫流行血清型RT-PCR鉴别诊断技术的建立被引量：2: 2015年; 目的建立口蹄疫流行株不同血清型RT—PCR的鉴别诊断技术，为有效防控口蹄疫提供技术支撑。方法根据GenBank中的A型、0型、Asial型口蹄疫病毒的全基因组核酸序列，用Primer5．0设计该3型口蹄疫病毒的通用引物及特异性分型引物，建立RT—PCR方法，采用1％琼脂糖凝胶电泳结合测序技术对引物的特异性和广谱性进行分析。结果1％琼脂糖电泳结果表明通用引物P1／P2能同时特异性扩增A、O、Asial型口蹄疫病毒，扩增片段大小为457bp，与预期值相一致。A、O、Asial型分型引物只能扩增相应亚型口蹄疫病毒的目的基因片段（大小分别为320、240和460bp），与预期值相一致。不能扩增其他2种亚型。Blast比对显示分型引物扩增产物序列经测序验证与其亚型完全对应，同源性为84％～99％。结论建立的RT—PCR诊断技术对口蹄疫病毒通用型扩增具有广谱性，对基因亚型分型具有特异性，可用于口蹄疫病检测及其流行病学调查。; 程凯慧侯佩莉宋玲玲赵贵民郇延军王洪梅何洪彬; 关键词：口蹄疫 RT-PCR

BVDV/IBRV主要抗原表位E2/gD基因串联表达及免疫原性被引量：4: 2014年; 为开发研制牛病毒性腹泻-黏膜病毒(BVDV)及牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的联合亚单位疫苗,开展了BVDV E2蛋白、IBRV gD蛋白主要抗原表位串联表达及免疫原性研究。利用2步PCR法获得E2-gD基因,构建原核表达载体pET28a-E2-gD,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE结果显示重组蛋白表达,BCA工作盒测定纯化蛋白浓度为2.69 mg/mL;Western-blot结果显示其具有作为免疫原的特异性;免疫家兔制备抗血清,血清中和试验结果表明,中和抗体效价为44.7(IBRV)/22(BVDV)。这说明E2-gD蛋白免疫原性较好,可诱导产生较高效价的中和抗体。; 侯亚兰侯佩莉李杰王洪梅何洪彬; 关键词：BVDV E2 免疫原性 BVDV E2

牛传染性鼻气管炎病毒gD基因截短表达及其抗血清制备被引量：2: 2013年; gD糖蛋白是IBRV感染细胞的主要分子,在病毒吸附和侵入宿主细胞中发挥着重要作用。利用IBRV基因组DNA为模板,经生物学软件DNAstar分析主要抗原区,PCR扩增gD基因786bp片段,定向连接到pET32a(+)表达载体中,筛选阳性克隆转化BL21(DE3)表达菌中,IPTG诱导表达部分可溶的重组蛋白。Ni-NTA非变性纯化系统纯化蛋白,纯化的蛋白免疫新西兰兔制备抗血清,利用间接ELISA法检测抗血清效价为1∶6400;同时以该血清进行血清中和病毒实验,中和指数为1∶640,显示该抗血清具有良好的抗病毒能力,为进一步开发牛传染性鼻气管炎(IBR)的诊断检测试剂和疫苗奠定了重要基础。; 张辉宋玲玲杨宏军王洪梅武建明候佩莉何洪彬王立群; 关键词：牛传染性鼻气管炎病毒原核表达抗血清

人抗凝血酶Ⅲ的表达及其抗血清的制备被引量：4: 2013年; 目的用大肠杆菌系统表达重组的抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ),制备其抗血清并测定效价。方法利用基因克隆技术获得AT-Ⅲ基因片段,构建原核表达质粒pET32a(+)-AT-Ⅲ,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,IPTG诱导表达、蛋白纯化并免疫兔,间接ELISA、Western blot法检测抗血清。结果 SDS-PAGE、Western blot法检测原核表达蛋白结果显示,在相对分子质量(Mr)77 000附近出现特异性条带。对该融合蛋白进行分离纯化后免疫新西兰兔,制备AT-Ⅲ抗血清,间接ELISA方法检测抗血清的最高效价可达到1∶12 800,Western blot分析表明抗血清可与293T、CHO细胞表达的AT-Ⅲ蛋白及AT-Ⅲ蛋白纯品特异性结合。结论成功制备了人抗凝血酶Ⅲ抗血清。; 卜澍王洪梅孙涛刘文浩王立群何洪彬; 关键词：原核表达抗血清

肠道病毒71 VP1基因的原核表达及其抗血清的制备被引量：5: 2013年; 目的克隆并表达重组肠道病毒71(EV71)VP1基因,进行抗血清的制备并检测抗血清效价。方法利用原核表达系统将PCR获得的VP1片段构建成原核表达载体pET32a(+)-VP1,诱导其表达VP1融合蛋白并利用包涵体纯化方法进行重组蛋白的纯化,将纯化的重组蛋白免疫新西兰兔制备VP1抗血清,ELISA检测抗体效价。同时构建真核表达载体,利用其在真核细胞中的瞬时表达检测抗血清的特异性。结果通过克隆获得VP1原核表达载体,IPTG诱导VP1蛋白表达并纯化,SDS-PAGE结果显示重组蛋白表达且纯化浓度较高,将重组蛋白乳化后免疫新西兰兔3次,取血检测抗血清的效价,ELISA结果显示抗体效价为1∶64 000,利用所构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-VP1表达VP1对抗血清进行检测,Western blot结果表明抗血清可较好的与VP1特异性结合。结论制备具有免疫原性的VP1蛋白及其效价较高的抗血清,为进一步研究抗EV71诊断方法、血清学诊断试剂盒及抗病毒疫苗的研制奠定基础。; 谢维欣武建明李杰方永志王洪梅何洪彬; 关键词：肠道病毒71 VP1 抗血清抗体效价

人血小板生成素基因的克隆及CHO稳定细胞系的建立: 2013年; 以人肝cDNA为模板克隆了人血小板生成素(Human Thrombopoietin,hTPO)基因,利用基因重组技术构建了带有新霉素抗性基因(neo)筛选标记的pcDNA3.1(+)-hTPO真核表达载体,将重组质粒瞬时转染293T细胞,用鼠抗人TPO单抗Western blot检测TPO蛋白的瞬时表达;再将重组质粒转染中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary,CHO),应用400μg/mL的G418筛选克隆,经PCR及Western blot验证,获得了3株hTPO蛋白表达水平不同的CHO细胞系,为获得大量蛋白并进行活性功能试验及临床应用奠定基础。; 马倩倩宋玲玲王红梅方永志王立群何洪彬; 关键词：人血小板生成素基因克隆 WESTERN BLOT

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国家自然科学基金(31272586)