江苏省教育厅自然科学基金(02KJD310002)
- 作品数：3 被引量：10H指数：3
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- 周期型马来丝虫HSP70基因原核表达载体的构建及表达产物的分析被引量：3
- 2006年
- 目的 在大肠埃希菌宿主系统中表达周期型马来丝虫热休克蛋白70（HSP70）基因，并对表达产物进行SDS—PAGE分析。方法以重组质粒pGEM—T—HSP70为模板，根据报道的HSP70基因序列设计合成一对引物，用PCR法扩增HSP70基因（包括完整开放读码框架片段及其上下游序列共长2198bp），PCR产物定向插入原核表达载体pGEX-4T-3中，构建的重组质粒pGEX-4T-3-HSP70经双酶切鉴定。将重组质粒转化大肠埃希菌BL21（DE3），用IPTG诱导GST．Tag融合蛋白的表达。经SDS—PAGE分析并经凝胶图像分析确定目的蛋白的表达水平。结果重组表达质粒pGEx-4lT-3-HSP70全长约7200bp，经双酶切后应得到长度为4968bp的载体和2198bp的目的基因2个片段，1％琼脂糖凝胶电泳显示结果同预期完全相符。HSP70相对分子质量（Mr）为70×10^3，质粒pGEX-4T-3的融合部分（GST．Tag）表达产物的胁约为26×103，将重组质粒转化BL-21（DE3）菌。经IPTG诱导表达，菌体蛋白的SDS—PAGE图谱显示，诱导组出现特异性蛋白表达条带，其Mr约100×10^3，与预计大小相同。目的蛋白占菌体总蛋白的12％左右。结论 成功地构建了重组原核表达载体pGEX一4T一3-HSP70：周期型马来丝虫HSP70基因可在大肠埃希菌中稳定表达，为制备和纯化表达蛋白以及丝虫病疫苗的进一步研究打下基础。
- 方政吴建军陈阳黄为群姜声扬石佑琴
- 关键词：周期型马来丝虫热休克蛋白质70基因重组基因表达
- 周期型马来丝虫副肌球蛋白基因真核表达重组质粒构建被引量：4
- 2007年
- 提取周期型马来丝虫总RNA。跟据已知的马来丝虫副肌球蛋白(BmPmy)基因序列,设计合成引物,并引入HindⅢ和BamHⅠ酶切位点,应用RT-PCR技术,扩增BmPmy基因片段,克隆至载体pGEM-T中,经PCR和双酶切鉴定后,亚克隆至真核表达质粒pcDNA3.1(+),成功构建了真核表达载体pcDNA3.1(+)-BmPmy,并转染COS-7细胞后进行RT-PCR分析。转染的COS-7细胞高水平表达周期型马来丝虫副肌球蛋白mRNA,结果与预期相符。
- 陈阳方政黄为群谢东方姜声扬吴建军
- 关键词：周期型马来丝虫副肌球蛋白真核表达质粒COS细胞
- 周期型马来丝虫副肌球蛋白基因克隆、序列分析及编码产物B细胞表位预测被引量：3
- 2007年
- 目的克隆周期型马来丝虫副肌球蛋白(BmPmy)基因,进行序列测定、分析及编码产物的B细胞表位预测。方法从周期型马来丝虫虫体中抽提总RNA,以mRNA为模板,RT-PCR法体外扩增BmPmy基因,扩增产物经初步鉴定后将其克隆入pGEM-T载体,转化E.coli DH5a,筛选阳性克隆,进行双酶切及PCR扩增鉴定,获得阳性重组质粒pGEM-T-BmPmy,经测序验证,并进行同源性比较。应用5种参数和方法对其编码产物进行B细胞表位预测。结果RT-PCR扩增出一条约2640bp的特异性条带,重组质粒双酶切的PCR结果与预期相符,DNA序列分析与基因库已知的基因序列同源性为99%。经表位预测分析,BmPmy的B细胞表位可能在54～66位、144～152位、770～780位和834～845位氨基酸区域。结论成功构建了BmPmy重组质粒pGEM-T克隆载体,为进一步研究该基因的功能提供了条件。
- 陈阳方政姜声扬黄为群谢东方吴建军石佑琴
- 关键词：原肌球蛋白
