江苏省卫生重大课题基金
- 作品数：12 被引量：34H指数：4
- 相关作者：许文林陈巧云房新建陈琛方莉莉更多>>
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- 一种新CD44变异体(CD44v17)在乳腺癌组织中的表达及其临床意义被引量：8
- 2010年
- 目的:探讨一种新CD44变异体(CD44v17)在乳腺癌组织中的表达及其临床意义。方法:根据本实验室在MCF-7/Adr中新发现的一种CD44剪切拼接变异体CD44v17(基因库NO.FJ216964)设计特异性引物,应用SYBRG reenⅠ荧光染料,采用实时PCR法检测了52例乳腺癌组织及相应癌旁组织CD44v17 mRNA的表达情况,根据标准曲线计算出CD44v17 mRNA的表达量,分析CD44v17 mRNA表达与乳腺癌临床生物学特性之间的关系。结果:乳腺癌组织CD44v17 mRNA表达(3.10±1.12)明显高于相应癌旁正常组织(2.31±0.84)(P<0.01);乳腺癌淋巴结转移组(4.07±1.13)显著高于无淋巴结转移组(2.75±0.89)(P<0.01);肿瘤组织>5 cm组CD44v17 mRNA表达(4.18±0.95)明显高于肿瘤组织≤5 cm组(2.96±1.07)(P<0.05);髓样癌(5.27±0.30)显著高于导管内癌(3.28±1.08)和浸润性导管癌(2.92±1.04)(P<0.05),导管内癌和浸润性导管癌CD44v17 mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05);乳腺癌临床Ⅲ期CD44v17 mRNA表达(4.18±0.92)明显高于Ⅰ期(2.73±0.97),Ⅱ期(2.76±0.96)(P<0.05);乳腺癌CD44v17 mRNA表达与雌激素受体、孕激素受体(progesterone receptor,PR)和cerbB-2表达无明显相关性(P>0.05)。结论:CD44v17 mRNA在乳腺癌组织中高表达,在乳腺癌的发生发展中起重要作用,可能与乳腺癌的侵袭、转移及预后有关。
- 弓晋灵许文林李娟杨靖吴晓君陈巧云
- 关键词：实时荧光定量PCR乳腺癌
- vegf shRNA对耐药白血病细胞化疗敏感性的增强作用被引量：2
- 2011年
- 本研究采用RNA干扰技术探讨血管内皮生长因子(VEGF)对耐药白血病细胞K562/A02药物敏感性的影响及其机制。针对人vegf基因合成3个特异性shRNA干扰片段,采用脂质体介导的方法将其导入K562/A02细胞,用RT-PCR检测vegf及mrp1的mRNA表达水平,用Western blot检测VEGF、MRP1、AKT及P-AKT的蛋白表达情况,用MTT法检测阿霉素对各组细胞的半数抑制浓度(IC50),用流式细胞术检测细胞凋亡、胞内罗丹明123(Rho123)积聚情况。结果表明:转染vegf shRNA后,K562/A02细胞vegf的mRNA表达下调,其中vegf shRNA2组和vegf shRNA3组与HK组比较有显著差异(p<0.05),以vegf shRNA3组最显著,VEGF蛋白表达也出现下调,与mRNA的表达基本一致;MTT检测结果显示阳性转染组对阿霉素的敏感性增加,其中vegf shRNA2组和vegfshRNA3组的半数抑制浓度(IC50)与HK组比较具有显著的统计学差异(p<0.05);阳性转染组胞内Rho123积聚增多,与HK组比较均有统计学差异(p<0.05);阳性转染组细胞凋亡增加,其中vegf shRNA2组和vegf shRNA3组与HK组比较有统计学意义(p<0.05);阳性转染组MRP1mRNA蛋白及表达均下调,以vegf shRNA3组下调最显著;阳性转染组P-AKT的表达水平低于对照组,以vegf shRNA3组最明显,而总的AKT无明显变化。结论:vegf shR-NA可以抑制vegf的基因的转录及翻译,从而增加耐药白血病细胞对阿霉素的敏感性,其机制可能是vegf shRNA通过抑制PI3K/AKT信号转导通路的活化而促进细胞凋亡及下调MRP1的表达。
- 沈慧玲方莉莉陈琛房新建陈巧云李娟许文林
- 关键词：VEGFSHRNA白血病K562/A02细胞MRP1
- 塞来昔布逆转MCF-7/Adr细胞多药耐药及其机制探讨被引量：6
- 2009年
- 目的观察环氧合酶-2(COX-2)抑制剂塞来昔布对肿瘤多药耐药(MDR)的逆转作用,并探讨其初步作用机制。方法在乳腺癌耐药细胞株MCF-7/Adr中,应用MTT方法检测塞来昔布对多柔比星(阿霉素,DOX)的耐药逆转倍数;RT-PCR及Western blot方法检测基因及蛋白的变化;流式细胞术(FCM)检测细胞膜P-gp的表达、功能、细胞周期和凋亡。结果塞来昔布作用24小时后,MCF-7/Adr细胞对DOX的敏感性明显增加,浓度为10μmol/L及20μmol/L时,耐药逆转倍数分别为1.82和3.80,呈现剂量依赖性。COX-2、mdr1、c-Jun、YB-1、survivin等在基因和蛋白水平明显下调(P<0.01),NF-κB无明显差异(P>0.05);20μmol/L作用24小时,P-gp的功能受抑制;G0+G1期细胞增多,S期细胞减少(P<0.05),凋亡率明显增高(P<0.05)。结论选择性环氧合酶-2抑制剂塞来昔布可有效逆转MCF-7/Adr细胞多药耐药,在一定的浓度范围内呈现剂量依赖性,初步机制可能涉及干预转录因子的表达而下调mdr1,阻滞细胞周期及增加细胞凋亡。
- 陈琛许文林秦茹娟房新建方莉莉陈巧云
- 关键词：MCF-7/ADR细胞塞来昔布P糖蛋白
- Hsa-mir-216a真核表达载体的构建及其在胃癌细胞SGC7901/DDP中的表达
- 2011年
- 目的:构建人mir-216a真核表达载体,实现其在胃癌细胞SGC7901/DDP中的表达,为进一步研究mir-216a的功能打下基础。方法:依据miRBase数据库中pre-mir-216a序列设计引物;PCR扩增pre-mir-216a基因并将其克隆至pGenesil-1载体;将pGenesil-1-hsa-mir-216a质粒转染SGC7901/DDP细胞,RT-PCR及实时定量RCR法检测成熟mir-216a在SGC7901/DDP细胞中的表达。结果:pGenesil-1-hsa-mir-216a质粒经酶切及测序鉴定正确;pGenesil-1-hsa-mir-216a质粒转染进SGC7901/DDP细胞后,RT-PCR检测mir-216a成熟体表达明显增强,实时定量PCR检测S/D/mir-216a组mir-216a成熟体表达较S/D/HK组上调(63.530±0.159)倍(t=1.201,P<0.01)。结论:成功构建了pGenesil-1-hsa-mir-216a真核表达质粒,并在胃癌细胞SGC/DDP中高效表达。
- 徐红美许文林姚俊冷加燕吴晓君陈巧云
- 关键词：真核表达载体转染
- 血管内皮生长因子对胃癌BGC-823细胞多药耐药相关蛋白1启动子活性的影响
- 2010年
- 目的:检测血管内皮生长因子(VEGF)对多药耐药相关蛋白1(MRP1)基因启动子转录活性的影响并初步探讨其作用机制。方法:合成MRP1启动子片段,克隆到荧光素酶报告基因载体PGL3-Basic中;用脂质体2000将重组的报告基因载体与内参质粒β-半乳糖苷酶(β-gal)瞬时共同转染人胃癌BGC-823细胞,检测VEGF作用后MRP1启动子活性的改变;继之,采用PI3K/AKT信号通路抑制剂LY294002预处理转染的细胞,再检测VEGF对MRP1启动子转录活性的影响。结果:酶切鉴定和DNA序列分析表明成功地构建了重组PGL3-Basic-MRP1载体;荧光素酶活性分析表明重组PGL3-Basic-MRP1在BGC-823细胞中具有启动子活性(144±3.0),与空载体PGL3-Basic(60±4.910)相比,转录活性增高2.4倍,差异有统计学意义(P<0.01);VEGF能以剂量依赖的方式上调MRP1启动子区的转录活性,与无VEGF作用组(171±6.083)相比,最大活性(924±19.975)增高5.4倍(P<0.05);LY294002能够显著抑制VEGF对MRP1启动子区的转录激活,当LY294002浓度为50μmol/ml时,MRP1启动子活性(392±25.541)与无LY294002作用组(1001±11.533)相比下降2.5倍(P<0.05)。结论:VEGF对MRP1启动子活性具有上调作用,PI3K/AKT信号通路在这一过程中发挥了重要作用。
- 李娟许文林弓晋灵杨靖吴晓君陈巧云
- 关键词：多药耐药相关蛋白1血管内皮生长因子荧光素酶报告基因启动子活性
- shRNA干扰VEGF表达对白血病细胞多药耐药的影响被引量：3
- 2009年
- 目的:探讨血管内皮细胞生长因子(VEGF)与人白血病耐药细胞株K562/A02细胞多药耐药的关系及其机制。方法:针对VEGF基因设计合成3条干扰片段shRNA1,2,3,采用脂质体2000分别将其转染入K562/A02细胞,RT-PCR法检测VEGF和多药耐药相关基因MDR1,MRP1,topoⅡ,GST的mRNA水平;蛋白质印迹法检测VEGF蛋白水平;MTT法检测各组细胞对多柔比星的半数抑制浓度(IC50值)。结果:K562/A02细胞VEGFmRNA表达水平显著高于敏感株K562细胞,差异有统计学意义(P<0.01),且VEGF蛋白水平也显著高于K562细胞;转染shRNA后,K562/A02细胞中VEGFmRNA水平出现不同程度下调,其中shRNA2组和shRNA3组与转染随机片段组比较差异有统计学意义(P<0.05),以shRNA3组下调最显著,并且VEGF蛋白水平也出现相应的下调;转染48 h后K562/A02细胞中MDR1,MRP1及topoⅡ的mRNA水平均出现不同程度下调,以shRNA3组下调最显著,分别下调(39.7±1.21)%,(29.1±0.97)%,(28.2±1.04)%,GST基因表达则无明显变化;阳性转染组细胞对多柔比星的敏感性明显增加,其中以shRNA3组最显著。结论:VEGFshRNA可以抑制K562/A02细胞VEGF基因与蛋白的表达,不同干扰片段的沉默效果不同,并增强K562/A02细胞对多柔比星的敏感性,其机制可能与MDR1,MRP1及topoⅡ的表达下调有一定的关系。
- 方莉莉许文林陈琛房新建陈巧云李娟
- 关键词：RNA干扰K562/A02细胞多药耐药
- Y-盒结合蛋白1短发夹环RNA真核表达载体的构建被引量：2
- 2007年
- 目的:构建Y-盒结合蛋白1(Y-box binding protein-1,YB-1)特异性短发夹环RNA(shRNA)真核表达载体。方法:采用人U6SnRNA启动子,分别把被9 bp序列间隔的19 bp长短的YB-1靶序列的反向重复序列,置于pGensil-1质粒载体中,构建成YB-1短发夹环RNA,产生重组质粒pGensil-1/U6/YBX11,pGensil-1/U6/YBX12及pGensil-1/U6/YBX13。分别用PstⅠ和SalⅠ酶切鉴定;并将经酶切鉴定正确后的重组质粒作测序分析。结果:YB-1的特异性shR-NA片段被成功克隆进pGensil-1质粒中,SalⅠ酶切鉴定可切出400 bp大小的片段,DNA测序分析显示,重组质粒shRNA编码序列与设计片断的序列完全一致。结论:成功构建了针对YB-1的特异性shRNA真核表达载体pGensil-1/U6/YBX11,pGensil-1/U6/YBX12及pGensil-1/U6/YBX13,为进一步研究其基因功能打下了基础。
- 周磊磊许文林秦茹娟唐华容沈慧玲
- 关键词：RNA干扰YB-1短发夹环RNA
- CD44变异体(CD44v17)在食管癌中的表达及意义
- 2011年
- 目的:探讨CD44v17在食管癌中的表达及意义。方法:根据本实验室在MCF-7/Adr中发现的一种CD44剪切拼接变异体CD44v17(基国库序列号FJ216964)设计特异性引物,采用实时定量PCR法检测了73例食管癌组织及相应癌旁组织CD44v17 mRNA的表达情况,分析CD44v17 mRNA表达与食管癌临床生物学特性之间的关系。结果:食管癌组织CD44v17 mRNA表达明显高于相应癌旁正常组织(P<0.05);食管癌CD44v17 mRNA表达与肿瘤的大小、发生部位、病理类型均无相关性(P>0.05),而与食管癌的分化程度、临床TNM分期、淋巴结转移相关(P<0.05)。结论:CD44v17 mRNA在食管癌组织中高表达,可为临床预测食管癌恶性程度,浸润转移潜能,评估预后提供一种重要的参考指标。
- 姚俊许文林冷加燕徐红美吴晓君李皓陈巧云
- 关键词：实时定量PCR食管癌淋巴结转移
- CD44基因变异体对人乳腺癌细胞株MCF-7的侵袭作用被引量：4
- 2010年
- 目的探讨一种新的CD44基因变异体（CD44v17）对人乳腺癌细胞株MCF-7侵袭能力的影响及其机制。方法以人乳腺癌耐阿霉素细胞株（MCF-7／ADR）cDNA为模板，采用聚合酶链反应（PCR）扩增目的片段，将其T．A克隆后，进行测序；构建CIM4v17质粒真核表达载体（pcDNA3．1-CD44v17）；应用脂质体转染法将pcDNA3．1-CD44v17转染入MCF-7细胞中，采用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）及明胶酶谱法测定转染细胞基质金属蛋白酶（MMP）-2和MMPO的表达；Transwell法检测CD44v17对MCF-7细胞的侵袭力；Western blot检测胞外信号调节蛋白激酶（ERK）及磷酸化蛋白激酶（p-ERK）变化。结果限制性内切酶消化证实，重组载体已正确克隆；DNA序列分析显示，CD44v17包含CD44基因1～4号外显子、16～17号外显子、18号外显子1～205位碱基（GeneBank NO．FJ216964）。MCF-7细胞转染pcDNA3．1-CD44v17后，CD44mRNA表达量和蛋白表达率分别为0．92±0．22和（70．0±2．5）％；透明质酸（HA）处理后，MMP-2mRNA表达量和蛋白活性分别为0．72±0．22和1．14±0．12，MMPOmRNA表达量和蛋白活性分别为0．85±0．19和1．23±0．25，细胞侵袭能力明显增加，侵袭细胞数目为352±33个／视野，而CD44单抗可以阻断这种作用；CD44单抗和促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路抑制剂预处理转染细胞后，显著阻断了p-ERK的表达。结论在MCF-7／ADR细胞中发现CD44v17，并成功克隆和建立pcDNA3．1-CD44v17；HA与CD44v17受体结合，通过CD44→ras→MAPK信号传导通路调节MMP-2和MMPO的表达，从而增加MCF-7细胞的侵袭力。
- 房新建许文林弓晋灵陈琛方莉莉陈巧云
- 关键词：基质金属蛋白酶-2基质金属蛋白酶-9肿瘤侵袭
- 汉防己甲素干预K562细胞mdr1基因表达的研究被引量：9
- 2008年
- 目的观察汉防己甲素（TTD）对阿霉素诱导的K562细胞mdr1基因表达的影响，并初步探讨其机制。方法采用MTT法观察TTD对K562细胞的毒性作用，以0．6 μg/ml阿霉素单独作用或0．6 μg/ml阿霉素联合不同浓度的TTD（0．5、1．0、2．0 μg/ml）作用于K562细胞，用RT—PCR法检测mdr1 mRNA、NF—κB mRNA水平，用流式细胞术检测P—gp的表达情况，用胞内罗丹明123（Rh0123）积聚试验检测P—gP的功能。结果空白对照K562细胞未见明显mdr1 mRNA及P-gP表达（水平分别为0．171±0．012、7．85±0．15），细胞内Rh0123平均荧光强度（反映P—gP功能）为711．9±63．6，NF—κB mRNA水平为0．783±0．090；0．6 μg／ml阿霉素作用24h后mdr1 mRNA、P—gP、NF—κB mRNA表达上调为0．428±0．012、73．68±1．84、1．075±0．047，细胞内Rh0123平均荧光强度下降为347．8±60．6（P值均〈0．05）；2．0 μg／ml TTD预作用24h再与0．6 μg／ml阿霉索联合作用24h能显著抑制阿霉素诱导的mdr1 mRNA、P—gP表达及功能、NF—κB mRNA的上调（分别为0．148±0．006、7．18±0．38、799．7±45．8、0．627±0．098）（P〈0．05），而0．5、1．0 μg／ml TTD无明显影响。结论TTD以浓度依赖性的方式干预阿霉素诱导的mdr1 mRNA、P—gP表达和P-gP功能的上调，其机制可能与TTD抑制了阿霉素诱导的NF—κB的表达有关。
- 吕旭晶许文林罗文娟王法春陈巧云
- 关键词：K562细胞汉防己甲素MDR1基因
