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HPV-11 E7重组腺病毒体外转染树突细胞对其功能的影响: 2007年; 目的研究腺病毒载体介导HPV-11 E7基因转染树突细胞（DC）对其表型和功能的影响。方法用最佳感染滴度（MOI）重组腺病毒pAD—E7转染成熟DC，流式细胞仪检测转染前后DC表型变化,并用^3H—TdR掺入法检测转染前后DC刺激同种淋巴细胞增殖的能力及ELISA检测DC、T细胞共同培养上清中细胞因子的水平。结果MOI100为pAD—E7转染DC最佳滴度，pAD—E7转染成熟DC前后对细胞表面的特征性表型CD1a、CD83及CD40、HLA—DR无影响，转染后的DC仍具有较强的刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力，能刺激T细胞分泌大量IFN-γ、IL-12。结论pAD—E7转染成熟DC对其功能无明显影响．转染后的DC与T细胞共孵育能诱导T细胞向Th1细胞极化。; 王飞相文忠毕志刚李光富刘丰吴海玮张兆松; 关键词：尖锐湿疣乳头状瘤病毒树突细胞

人乳头瘤病毒11型E7蛋白基因重组腺病毒载体的构建及表达被引量：4: 2005年; 目的构建人乳头瘤病毒11型(HPV11)E7蛋白基因腺病毒载体,并在真核细胞表达。方法用PCR法,扩增出HPV11E7基因,定向克隆至pENTR-TOPO载体形成重组质粒TOPO-E7。TOPO-E7与腺病毒载体pAD/CMV/V5-DESTTM重组反应,E7基因被重组到腺病毒载体上。该载体经PacI酶切,脂质体法转染人胚肾293A细胞,获得重组腺病毒载体pAD-E7。pAD-E7转染人HaCaT细胞,激光共聚焦显微镜分析E7蛋白表达情况。结果经酶切及序列分析鉴定,重组质粒TOPO-E7成功构建。重组子pAD-E7转染293A细胞后,获得滴度为1.4×107pfu/mL的重组腺病毒载体。该载体转染HaCaT细胞,48h后激光共聚焦显微镜下可见细胞内E7蛋白表达。结论重组腺病毒载体能有效介导HPV11E7基因在真核细胞的表达。; 王飞毕志刚李光富吴海玮王群刘丰王新军张兆松; 关键词：人乳头瘤病毒11型基因重组腺病毒载体 HPV11 真核细胞表达脂质体法人胚肾

人乳头瘤病毒11型E7蛋白基因的克隆和表达被引量：2: 2004年; 目的从尖锐湿疣皮损标本中扩增出人乳头瘤病毒11型(HPV11)E7蛋白基因,并进行表达、纯化和鉴定。方法用PCR法,从尖锐湿疣标本中扩增出HPV11E7蛋白基因,与pGEX-6P-1载体连接成重组表达质粒pGEX-6P-1/E7;重组质粒转入BL21大肠杆菌,经诱导表达融合蛋白GST-E7;该蛋白经剪刀酶切除GST,GlutathioneSepharose4B亲和层析柱纯化,SDS-PAGE和蛋白质印迹法检测鉴定。结果经酶切及序列分析鉴定,重组质粒pGEX-6P-1/E7成功构建,诱导后高表达GST-E7融合蛋白并得到纯化,蛋白质印迹证实表达蛋白为E7蛋白。结论获得高表达、高纯度的HPV11E7蛋白,为该蛋白的功能及免疫学分析及尖锐湿疣疫苗研究打下了基础。; 王飞毕志刚王群李光富王新军张兆松; 关键词：人乳头瘤病毒11型基因克隆基因表达人乳头瘤病毒感染尖锐湿疣

LDH法检测pcDNA-HPV16L1免疫小鼠CTL活性的研究: 2007年; 目的观察pcDNA-HPV16L1免疫BALB/c小鼠细胞毒性T细胞(CTL)活性变化,建立简便易行的CTL检测体系,为人乳头瘤病毒(HPV)疫苗免疫中CTL作用的研究奠定基础。方法用pcDNA-HPV16L1转染的小鼠黑色素瘤B16细胞作为靶细胞,用pcDNA-HPV16L1免疫BALB/c小鼠(观察组)并以乳酸脱氢酶(LDH)法检测其CTL活性,设空质粒组与空白组作为对照(分别肌注空质粒和葡萄糖)。结果与空质粒组和空白组比较,观察组CTL活性显著增强。结论pcDNA-HPV16L1免疫小鼠的CTL活性增强,LDH法可稳定检测。; 高慧王琴成蓓朱晓芳毕志刚; 关键词：细胞毒性T淋巴细胞 BALB/C小鼠

人乳头瘤病毒11型E7与共刺激分子CD80嵌合DNA疫苗质粒的构建及鉴定被引量：1: 2005年; 目的:构建人乳头瘤病毒11型(HPV ll)E7与共刺激分子CDS0嵌合DNA疫苗质粒。方法:从尖锐湿疣病变组织中提取DNA制备模板,采用聚合酶链反应(PCR)技术扩增HPV ll-E7基因,经双酶切后定向克隆到pcDNA3.1(+)中,获得pcDNA3.1(+)/HPV llE7,测序鉴定后,再用PCR方法扩增去除终止密码子的E7基因片段,按上述方法插入质粒pcD-NA3.1(+)/CD80中CD80上游,构建pcDNA3.1(+)/HPV llE7-CD80融合基因真核表达质粒。结果:去除终止子的E7基因片段成功正向插入CD80上游,双向测序分析显示序列无误,pcDNA3.1(+)/HPV llE7-CD80嵌合真核表达质粒构建成功。结论:HPV ll-E7/CD80嵌合DNA疫苗质粒构建成功,为研究该疫苗在尖锐湿疣防治中的作用奠定了基础。; 李莉华黄朝晖毕志刚刘志辉任金冬龚佩娟王飞; 关键词：人乳头瘤病毒 CD80 基因克隆聚合酶链反应

人乳头瘤病毒16 E6/7转基因小鼠模型的建立被引量：4: 2007年; 目的构建pCEP4-HPV16 E6/7真核表达质粒,通过显微注射法建立HPV16 E6/7转基因小鼠模型。方法应用基因重组技术,构建pCEP4-HPV16 E6/7真核表达质粒,将经线性化的包含启动子、目的基因、PolyA尾的完整的真核表达DNA,通过将外源基因显微注射到供体小鼠受精卵的雄原核中,再植入到假孕受体鼠的输卵管中,获得129只F0代小鼠.常规法提取这些转基因小鼠的基因组DNA,进行PCR分析,得到5只原代转基因小鼠,再进行DNA印迹分析,其中4只小鼠的DNA出现与阳性质粒对照类似的特异条带,说明E6/7整合在这4只小鼠的基因组中。将Founder小鼠与正常FVB配种,后代经PCR检测,统计结果符合孟德尔遗传定律,证明外源基因稳定遗传给后代。在4只5月龄F_0代阳性转基因小鼠中有2只小鼠耳朵皮肤出现不典型增生改变。结果成功构建了pCEP4-HPV16 E6/7真核表达质粒,用包含CMV启动子、HPV16 E6/7目的基因转基因的小鼠已出现皮肤组织不典型增生。结论获得可繁殖传代的整合了HPV16 E6/7基因的转基因小鼠模型。; 高慧黄正芳王琴李厚达毕志刚; 关键词：乳头状瘤病毒小鼠转基因微量注射

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江苏省重点学科建设基金(135-3)