国家自然科学基金(30500085)
- 作品数：6 被引量：8H指数：2
- 相关作者：杨渝珍赵贵森周婷黄巍刘桥更多>>
- 相关机构：华中科技大学武汉市医学科学研究所河南科技大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金武汉市卫生局科研项目湖北省自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 一种用于DNA甲基化分析的改进型亚硫酸氢盐转化法被引量：3
- 2007年
- DNA甲基化分析是认识生理、病理条件下基因表达变化的重要途径.亚硫酸氢盐转化是DNA甲基化分析的瓶颈.本文旨在改进琼脂糖-亚硫酸氢盐DNA处理方案(agarose bisulfite method),建立一种简便稳定、适合常规甲基化分析的亚硫酸氢盐转化法.把DNA包入普通琼脂糖,以饱和亚硫酸氢盐在较高的温度下快速处理,然后用离心柱型琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒,集DNA凝胶回收、脱盐、脱磺基和纯化于一体,完成整个转化过程.Bisulfite-PCR、克隆测序和酶切法分析转化率、转化特异性和转化物的质量.用该方案处理的HeLa细胞DNA,多个片段的转化率均大于98%,甲基化片段96.2%的CpG保持不变,可以扩增605bp的较大片段,灵敏度介于普通法和琼脂糖亚硫酸氢盐法之间,而重复性较二者都好.改良后的方案简化了操作流程,快速稳定,易学易用,可实现高效特异转化,适合于一般实验者对常规检材进行DNA甲基化分析.
- 赵贵森郑海燕莫耀南冯文芳杨渝珍
- 关键词：DNA甲基化亚硫酸氢钠琼脂糖
- Kozak序列(+4G)对携带EGFP标签的人淀粉样前体蛋白751在CHO细胞中表达的影响被引量：1
- 2011年
- 目的:观察Kozak序列(+4G)对稳定转染的人淀粉样前体蛋白(hAPP751)-EGFP融合真核表达载体在CHO细胞中表达的影响,为APP的水解代谢研究提供细胞模型。方法:分别将含Kozak序列(+4G)和不含Kozak序列的hAPP751全长基因片段亚克隆入pEGFP-N1表达载体,得到pEGFP-hAPP751(+4G)和pEGFP-hAPP751重组质粒,转染CHO细胞,通过G418筛选稳定转染细胞株,再用倒置荧光显微镜挑取绿色荧光强的细胞进行亚克隆,并观察融合蛋白的表达强度和细胞定位,最后用EGFP抗体通过Western印迹检测融合蛋白。结果:PCR、酶切和测序证明将含Kozak序列(+4G)和不含Kozak序列的hAPP751全长基因片段分别连入了真核表达载体pEGFP-N1中;荧光显微镜下观察pEGFP-hAPP751(+4G)稳定转染细胞的细胞膜和细胞质产生较强的绿色荧光,其中在细胞质中成不均匀颗粒状分布,Western印迹检测到相对分子质量约156 000的融合表达蛋白,与预期相符;pEGFP-hAPP751转染细胞,其绿色荧光十分微弱且在整个细胞均匀分布,Western印迹检测到相对分子质量约26 000的EGFP,但检测不到预期的hAPP751-EGFP融合表达蛋白。结论:Kozak序列(+4G)可以明显促进hAPP751的表达,获得稳定转染且高水平融合表达hAPP751-EGFP的细胞株。
- 黄巍庞蓓蓓熊波周婷刘桥
- 关键词：增强型绿色荧光蛋白
- APPβ分泌酶切割位点特异性单链抗体的制备和鉴定被引量：3
- 2012年
- 目的制备针对人淀粉样蛋白前体(APP)β分泌酶切割位点的特异性单链抗体(ScFv),并进行鉴定。方法设计扩增单克隆抗体细胞株重链和轻链可变区基因片段VH和VL的引物,利用RT-PCR技术,从本室制备的抗人APPβ分泌酶切割位点单克隆抗体细胞株中扩增出VH和VL基因片段,然后通过重叠引物延伸法(SOE)将VH和VL基因拼接成ScFv基因片段,再将其亚克隆入原核表达载体pET-28a中,转化E.coli BL21(DE3)诱导表达,目的蛋白经镍柱纯化和复性后,用SDS-PAGE、ELISA和Western blot等方法对其检测分析。结果成功从一株抗人APPβ位点单克隆抗体细胞株2H10中扩增出VH和VL并拼接成ScFv片段,片段长744 bp,编码248个氨基酸。PCR、酶切和测序表明表达载体构建成功,转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导可以表达出约29 ku的目的蛋白,主要为包涵体形式,经镍柱纯化和复性后,获得纯度达90%以上的ScFv蛋白,ELISA和Western blot检测表明可溶性ScFv可以与人APPβ分泌酶切割位点序列短肽和全长APP结合。结论成功构建并表达人APPβ分泌酶切割位点的特异性单链抗体,为进一步研究其生物学活性奠定基础。
- 黄巍周丽荣周婷孙红霞黄晓刚刘桥
- 关键词：Β分泌酶单链抗体阿尔采末病Β淀粉样蛋白
- SNP rs220028和STR HUMARA位点甲基化标记的时空稳定性研究被引量：1
- 2006年
- 目的调查印记SNPrs220028和X-STRHUMARA位点甲基化标记的时空稳定性,评估其实用价值。方法采用甲基化敏感性限制酶消化后PCR技术,对SNPrs220028和STRHUMARA位点进行甲基化等位基因特异性分型。实验涉及10例不同年龄男女个体的血液、心、脑、肝、肾等主要组织以及不同程度降解的组织标本。结果SNPrs220028和STRHUMARA的甲基化等位基因特异性分型不受检材年龄、组织种类和一般程度降解的影响。结论SNPrs220028和X-STRHUMARA位点的甲基化标记稳定性良好,有实际应用价值。
- 赵贵森艾红伟陈晖杨渝珍
- 关键词：SNP组织特异性
- 基因组差异甲基化片段筛选技术
- 2007年
- 分离和鉴定细胞之间的差异甲基化片段,不仅有助于了解基因的功能、分离疾病相关基因,而且可以发现与细胞分化或病变相关的甲基化标记。目前筛选差异甲基化DNA片段的方法主要有:甲基化敏感的限制性界标基因组扫描、甲基化敏感的代表性差异分析、甲基化敏感的限制性指纹技术、甲基化CpG岛扩增-代表性差异分析、微阵列技术等。其中微阵列法又先后建立有CpG岛微阵列、寡核苷酸微阵列和表达CpG岛序列标签微阵列。这些方法各有特点和适用范围,应根据具体研究目的和工作条件进行恰当的选择。
- 赵贵森杨渝珍
- 关键词：DNA甲基化表遗传学基因组扫描分子标记
- TACE基因shRNA真核表达载体的构建及其对HeLa细胞生物学活性的影响
- 2008年
- 目的构建靶向肿瘤坏死因子转换酶（TACE）的小发夹结构RNA（shRNA）的真核表达载体,观察干扰TA-CE表达对HeLa细胞增殖和凋亡的影响。方法设计针对TACE基因的4个shRNA序列,构建真核表达载体shR-NA1、shRNA2、shRNA3、shRNA4。通过酶切和测序等方法进行鉴定。转染HeLa细胞后,用Realtime PCR的方法检测其对HeLa细胞TACE基因表达的影响;用ELISA检测细胞分泌的sTNF-α,间接反映干扰TACE的效果;用MTT法检测细胞增殖活性;用DNA ladder和流式细胞术检测细胞凋亡。结果成功构建和筛选出了针对TACE基因的3个有效的特异性真核表达载体,且均在不同程度上抑制了HeLa细胞TACE基因的表达。ELISA检测结果与Realtime PCR实验结果相符。同时发现干扰TACE基因后,HeLa细胞的生长受到抑制,凋亡率升高,与对照组相比差异有显著性意义（P〈0.05）。实验组转染shRNA1~3后72h可见特征性的基因组DNA ladder条带。结论所构建的TACEshR-NA真核表达载体能显著抑制TACE的表达。干扰TACE基因的表达可有效抑制HeLa细胞的增殖并诱导其凋亡。
- 章杰闫媛杨渝珍杨业金
- 关键词：HELA细胞细胞凋亡
