国家自然科学基金(81261120386)
- 作品数：2 被引量：2H指数：1
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- CRISPR/Cas9介导下构建FN1敲除的DLD1细胞系及初步功能学研究
- 2021年
- [目的]利用CRISPR/Cas9技术构建FN1基因敲除的人结直肠腺癌DLD1细胞系,并初步探讨FN1基因敲除对DLD1细胞增殖、迁移的影响。[方法]根据CRISPR/Cas9技术原理,设计针对FN1基因的crRNA,体外混合crRNA、tracrRNA、Cas9酶,形成核糖核蛋白(即RNP复合物)后转染至DLD1细胞,实现基因编辑。采用二维梯度稀释法挑取单克隆细胞系,使用测序及蛋白质印迹技术(Western Blotting)检测FN1基因敲除情况,通过CCK8、Transwell及划痕实验检测FN1敲除对DLD1细胞增殖、迁移的影响。[结果]测序结果表明,8号单克隆细胞系在靶点附近缺失1 366个碱基,造成FN1编码基因的移码突变,蛋白翻译提前终止。与未编辑细胞相比,DLD1FN1-KO细胞的增殖及迁移能力明显降低。[结论]成功构建DLD1FN1-KO细胞系。初步证实,与未编辑细胞相比,DLD1FN1-KO细胞在第5d增殖水平减慢约40%(P <0.001)、迁移水平减慢约27%(P <0.001)。
- 李春静李斯阳李兴铃程雁
- 关键词：基因敲除
- 筛选调控Sonic Hedgehog信号转导的泛素连接酶被引量：2
- 2013年
- 目的 :发现调控Sonic Hedgehog(Shh)信号转导的泛素连接酶。方法 :第一轮筛选,利用荧光素酶报告基因(8×GliBS-Luc)检测系统,检测相应HECT家族E3泛素连接酶的siRNA对Shh信号通路活性的影响;第二轮筛选,利用细胞免疫荧光激光共聚焦检测系统,检测上述siRNA对Shh的受体Ptch1蛋白原纤毛定位的影响。综合2轮筛选结果,初步发现影响Shh信号通路活性的HECT家族E3泛素连接酶。结果:通过2轮筛选,发现Smurf1、Smurf2、Ube3c、Wwp1、Wwp2共5个泛素连接酶,不仅能调节Ptch1蛋白的原纤毛定位,也可以增加通路下游转录因子Gli的活性。结论:建立了筛选调控Shh信号通路的泛素连接酶的平台。在初步筛选的27个HECT E3泛素连接酶中,有5个成员参与调控Shh信号通路。
- 汤颖乐珅程雁
- 关键词：HEDGEHOG信号通路E3泛素连接酶
