国家自然科学基金(30771908)
- 作品数：9 被引量：9H指数：2
- 相关作者：鲍朗张会东黄毕张英郝牧更多>>
- 相关机构：四川大学中国医学科学院北京协和医学院更多>>
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- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- ompL17基因酵母双杂交系统的构建及筛选鉴定被引量：3
- 2008年
- 目的寻找钩体致病的信号传导通路,分析ompl17基因表达产物在体内相互作用的靶蛋白。方法分别构建诱饵质粒载体和血管内皮细胞cDNA文库,通过顺序性转染转入酵母细胞中,然后进行初步的鉴定。结果PCR和酶切分析证实构建成功了诱饵质粒载体和血管内皮细胞cDNA文库。结论成功构建酵母双杂交系统为发现ompl17基因表达产物在体内相互作用的靶蛋白奠定了基础。
- 张会东郝牧鲍朗黄毕高蕾
- 关键词：钩端螺旋体克隆
- 赖型钩体毒力相关基因ompL17的重组表达以及体外不同温度下的表达研究
- 2008年
- 目的:观察ompL17基因表达产物的免疫原性以及该表达蛋白在动物模型中的分布情况。方法:提取钩端螺旋体017株基因组DNA,扩增出ompL17基因,与表达载体pGEX-4T-1重组,诱导表达OMPL17蛋白,分析该基因在017株中体外不同温度的表达情况。结果:PCR和酶切分析证实构建成功了表达载体,SDS-PAGE分析证实诱导表达出OmpL17蛋白;体外不同温度下发现该基因不表达蛋白。结论:成功表达出ompL17基因的蛋白,体外不同温度未发现该蛋白的表达,为赖型钩体的分子机制的阐明奠定了基础。
- 张会东郝牧鲍朗黄毕高蕾
- 关键词：钩端螺旋体克隆
- 利用基因芯片对赖型钩体毒力基因差异表达与致病相关性的探讨被引量：1
- 2015年
- 目的通过对连续动物传代和试管培养的赖型钩端螺旋体部分致病基因表达差异性的检测,分析赖型钩端螺旋体特异性基因表达与毒力改变之间的联系,了解赖型钩端螺旋体致病过程和发病机制。方法将27只豚鼠分为3组(n=9),分别经腹部皮下接种1mL体内培养钩体(体内培养组)、体外培养钩体(体外培养组)或钩体培养基(培养基组),接种钩体浓度为108/mL并处于对数生长期。在接种后15d内观察其发病和死亡状况,测量其体温体质量变化情况,并于接种后第15d将存活豚鼠处死,测量脏器系数,了解经不同环境培养的钩体的毒力情况;以赖型钩端螺旋体标准株DNA为模板,采用PCR技术扩增出所选特定基因作为探针,使用点样仪进行芯片点样。分别提取经豚鼠体内连续数代培养的钩端螺旋体RNA与EMJH培养基中培养的钩端螺旋体RNA,逆转录后分别使用Cy5和Cy3进行荧光标记,并与基因芯片进行杂交。扫描后通过分析两种荧光强度的比值,了解赖型钩端螺旋体相关毒力基因的差异表达情况。结果接种后,体内培养组豚鼠存活率为0%,体外培养组豚鼠存活率为88.9%,培养基组豚鼠全部存活;体内培养组豚鼠较其余两组豚鼠体温升高(P<0.05)、体质量下降(P<0.05);体内培养组豚鼠心、肺、肾的脏器系数较体外培养组及培养基组豚鼠更大(P<0.05);解剖后,体内培养组豚鼠肺部出血情况较其余两组更为严重;通过基因芯片,检测到溶血素基因以及其他与钩体生存致病能力相关的基因呈现出不同程度的改变,溶血素基因LA1027、LA1029、LA4004、LA3050、LA3540、LA0327、LA0378、LA1650、LA3937、O抗原连接酶基因LA2089、鞭毛动力蛋白基因LA3576、外膜蛋白基因LA0011及Loa22基因上调。结论赖型钩体经连续体内培养后毒力增高,钩体毒力变化与其基因表达差异存在联系,了解这些基因的变化意义对阐明钩体的致病机制有重要意义�
- 余德立鲍朗
- 关键词：钩端螺旋体基因芯片毒力基因溶血素
- 赖型钩体毒力相关基因OmpL17表达纯化及其产物的趋化作用
- 2008年
- 目的研究钩体017株外膜蛋白新基因ompl17与钩体肺大出血的相关性。方法提取钩端螺旋体017株基因组DNA,扩增出ompL17基因,与表达载体pGEX-4T-1重组,诱导表达OMPL17蛋白,然后纯化得到活性表达产物,并建血管基底膜,分析该产物的趋化活性。结果SDS-PAGE和Western-blot分析证实诱导表达并纯化得到OMPL17蛋白,趋化作用分析证明该基因表达产物具有趋化活性。结论成功表达纯化出ompL17基因的蛋白,观察到该基因表达产物具有趋化活性,为赖型钩体的分子机制的进一步阐明奠定了基础。
- 张会东郝牧鲍朗黄毕高蕾
- 关键词：钩端螺旋体趋化
- 赖型钩端螺旋体Loa22重组质粒的蛋白表达和对巨噬细胞的毒性作用被引量：3
- 2008年
- 目的对赖型钩端螺旋体Loa22基因进行表达和功能研究。方法构建赖型钩端螺旋体Loa22成熟肽重组质粒,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)对重组质粒进行蛋白诱导表达,SDS-PAGE和Western Blotting检测目标蛋白表达情况。经亲和层析获得目标蛋白并作用于小鼠巨噬细胞ANA-1,检测细胞上清液中乳酸脱氢酶(LDH)活力、四氮唑复合物(XTT)吸光度值和细胞凋亡率以评价其细胞毒性。结果成功构建Loa22成熟肽原核表达质粒,通过鉴定并纯化得到Loa22成熟肽,该蛋白使培养ANA-1细胞上清液中LDH活力升高,XTT吸光度值下降,细胞凋亡率增加。结论Loa22对ANA-1具有明显的毒性效性,该基因可能是致病钩体的一个重要毒力相关基因。
- 张英鲍朗朱海龙黄毕章乐张会东
- 关键词：钩端螺旋体巨噬细胞细胞毒性
- 赖型钩端螺旋体溶血素HlyX对血管内皮细胞通透性的影响
- 2011年
- 目的:克隆表达赖型钩端螺旋体溶血素基因hlyX,观察其表达产物对人脐静脉内皮细胞(HU-VECs)通透性的影响,并初步探讨其机制。方法:将hlyX基因插入原核表达载体pET32a(+),构建重组质粒pET-hlyX,转化大肠杆菌BL21(DH3)以高效表达携带组氨酸标签的Trx-HlyX融合蛋白,并作亲和层析纯化。采用生物素标记白蛋白的酶联免疫吸附法测定目的蛋白对HUVECs单细胞层通透性的影响,并以流式细胞术及Ho-echst 33258荧光染色方法检测其作用于HUVECs后的细胞凋亡率。结果:成功构建了重组质粒pET-hlyX并高效表达出Trx-HlyX融合蛋白;与对照组相比较,蛋白Trx-HlyX作用于HUVECs后,明显增加其通透性(P<0.05),细胞凋亡率显著增加(P<0.05)。结论:重组质粒pET-hlyX高效表达出Trx-HlyX融合蛋白,纯化后的融合蛋白对HUVECs通透性有影响,且对HUVECs具有细胞毒性作用。
- 孙湛吴秉婷李道坤鲍朗
- 关键词：钩端螺旋体通透性人脐静脉内皮细胞
- 赖型钩端螺旋体OmpA外膜基因Loa22重组卡介苗的构建及其免疫蛋白表达被引量：1
- 2010年
- 目的以赖型钩端螺旋体外膜蛋白A(OmpA)膜蛋白基因Loa22去信号肽基因片段构建重组卡介苗并对其免疫蛋白进行表达分析。方法以赖型钩端螺旋体56601株全基因组DNA为模板,PCR扩增出Loa22成熟肽基因片段,与大肠杆菌-结核分枝杆菌穿梭整合质粒pMV361一起分别经过双酶切,连接,转化。筛选鉴定出阳性重组质粒rpMV361-loa22,电转化入BCG,经筛选鉴定后,热诱导表达,通过SDS-PAGE及Western Blotting鉴定其表达产物。分别用BCG、rBCG-pMV361、rBCG-loa22、Loa22蛋白、灭活全钩体免疫小鼠两次后,脱臼处死小鼠分离脾淋巴细胞,XTT比色法检测体外脾淋巴细胞增殖活性。结果PCR扩增获得516 bp的片段,成功构建重组穿梭质粒rpMV361-loa22,经电转化构建重组卡介苗成功,热诱导表达出相对分子质量约19×103特异条带。体外脾淋巴细胞增殖实验证实rBCG-loa22可引起细胞反应,其增殖活性与BCG组和rBCG-pMV361组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。结论成功构建了赖型钩端螺旋体重组卡介苗rBCG-loa22并高效表达具有免疫学活性的外膜蛋白Loa22,为新一代钩端螺旋体疫苗研究打下了基础。
- 李道坤鲍朗张英孙湛
- 关键词：赖型钩端螺旋体外膜蛋白A重组卡介苗免疫保护
- 赖型钩端螺旋体OmpA外膜蛋白Loa22通过Ca^(2+)信号通路介导A549细胞凋亡被引量：1
- 2011年
- 目的研究赖型钩端螺旋体(简称钩体)外膜蛋白Loa22通过Ca2+信号通路对细胞凋亡的影响,探讨该基因在钩体黏附侵袭细胞并诱导其凋亡过程中可能的信号传导机制。方法以人肺腺上皮细胞(A549)为模型,用100μg/mL纯化Loa22成熟肽作用于细胞24 h,检测细胞凋亡及细胞内游离钙浓度([Ca2+]i),观察F-actin细胞骨架变化,检测钙调素(CaM)mRNA表达水平。同时设磷脂酶C(PLC)特异阻断剂U73122预处理+Loa22成熟肽组,观察上述指标变化。结果 Loa22成熟肽作用A549后,细胞凋亡率升高,并诱导[Ca2+]i增加,CaMmRNA表达水平及乳酸脱氢酶(LDH)活性上升,F-actin细胞骨架重排。而预先用U73122预处理后,细胞凋亡率、[Ca2+]i、CaMmRNA和LDH活性均降低(P<0.01),F-actin细胞骨架重排程度减轻。结论 Loa22成熟肽通过PLC信号通路触发细胞[Ca2+]i升高,导致F-actin细胞骨架重排,从而引发细胞凋亡,提示该基因参与钩体侵袭细胞引发细胞凋亡病理过程,可能是致病性钩体的一个重要毒力相关基因。
- 吴秉婷鲍朗孙湛李道坤张英
- 关键词：赖型钩端螺旋体细胞凋亡钙调素
