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利用基因敲入技术在肝癌细胞系中稳定表达HBV的X抗原被引量：1: 2008年; 目的利用基因诱捕载体整合到人类肝癌细胞系SMMC7721细胞的染色体基因中,建立稳定表达HBx蛋白的细胞系。方法通过电击转染将基因诱捕载体pU17导入人类肝癌细胞系SMMC7721细胞,经G418筛选,报告基因X-gal染色,PCR,Western印迹等方法检测HBxDNA的存在和蛋白质的表达。结果得到永久性高表达诱捕载体报告基因X-gal的阳性克隆;用Cre-LoxP置换系统,将构建好的HBx全长片段与诱捕载体的报告基因部分交换,HBx全长片段完整地整合在SMMC7721细胞的染色体基因中,并能从该细胞系中检测到HBx抗原。结论本实验提供了一种新的稳定表达蛋白的方法。该细胞系为制备、纯化X抗原和研究X基因调控提供了实验材料。; 黄婷婷程丽英李毅蔡雪飞刘湘黄爱龙汤华; 关键词：基因整合

重组GST-HBx蛋白在表达过程中断裂状况的研究: 2011年; 目的在对乙型肝炎病毒非结构蛋白HBx研究的过程中,发现体外表达HBx蛋白产物的稳定性存在差异.为了了解其中的原因,拟通过原核表达方式进行分析.方法以包含全长HBV DNA的质粒pEco63为模板,通过PCR反应,扩增HBV X基因全长序列（1～154氨基酸）和截短序列（48～104氨基酸,48～146氨基酸,98～146氨基酸）,将这几种不同长度和位置的HBX DNA序列克隆到pGEX4T-2原核表达载体中,并通过下游引物设计中引入6×组氨酸标签序列.结果最终成功构建N端融合GST蛋白标签序列和C端融合6×组氨酸标签序列的4种HBx重组表达载体.将4种包含不同长度HBx的重组质粒转化大肠埃希菌Rosetta,培养至菌液浓度A值大约0.6左右,加入终浓度0.1 mmol/L的IPTG进行诱导表达.提取全菌蛋白通过Western印迹对HBx各重组蛋白产物的N端和C端进行检测.结论在分段表达的HBx重组蛋白中发生了多处局部的断裂,而断裂部位主要集中于GST蛋白上.而造成这一结果的原因可能与HBx蛋白功能区域暴露后与GST相互作用有关.; 蔡雪飞龚旭阳杜茜胡接力张文露胡源黄爱龙汤华; 关键词：HBX蛋白原核表达

HBV对肝癌细胞中AKR1C1基因表达的影响被引量：4: 2010年; 目的研究HBV对肝癌细胞中AKR1C1基因表达的影响,并对其作用机制进行初步的探讨。方法RT-PCR和Real-time PCR检测HepG2.2.15和HepG2细胞中AKR1C1基因的差异表达情况;构建AKR1C1基因启动子虫荧光素酶报告质粒,并分别与HBV、HBx、HBs、HBp、HBc的表达质粒共转染HepG2细胞,双荧光素酶检测系统检测虫荧光素酶活性。结果AKR1C1基因在HepG2.2.15细胞中的表达高于HepG2细胞1.5倍;在HBV表达质粒与AKR1C1基因启动子虫荧光素酶报告质粒共转染的HepG2细胞中,虫荧光素酶的活性明显增强,为对照组3.37倍;相对HBs、HBp、HBc,HBx升高虫荧光素酶的活性的作用最强。结论HBV可以增强AKR1C1基因启动子的转录活性,促进AKR1C1在肝癌细胞中的表达,HBx在这一转录激活当中发挥重要作用。; 万涛张小花张磊田园园丁世家汤华; 关键词：肝肿瘤基因表达

HBV通过增强DNAJB4启动子活性调节其在HepG2．2．15细胞中的表达被引量：4: 2009年; 目的初步探讨HBV与DNAJB4基因的转录调节作用机制。方法用RT-PCR及Real—timePCR检测HepG2．2．15细胞和HepG2细胞中DNAJB4在mRNA水平上的表达差异。构建DNAJB4启动子虫荧光素酶报告质粒，分别与HBV、HBs、HBp、HBc、HBx表达质粒共转染HepG2细胞，比较虫荧光素酶活性。结果在mRNA水平上，DNAJB4在HepG2．2．15细胞中的表达量是其在HepG2细胞中表达量的2．59倍，且二者有显著性差异（P〈0．01）。DNAJB4启动子虫荧光素酶报告质粒与HBV表达质粒共转染组的相对荧光素酶活性是其对照组的2．28倍。转染HBs和HBc表达质粒组的相对荧光素酶活性分别是其对照组的2．11倍和1．77倍，而HBx、HBp表达质粒对荧光素酶活性没有影响。结论在HepG2．2．15细胞中，HBV能通过增强DNAJB4启动子活性增加DNAJB4转录水平的表达，其中HBs和HBc蛋白起主要作用。; 张小花万涛张磊田园园黄婷婷汤华; 关键词：乙型肝炎病毒 HEPG2.2.15细胞基因表达与调控

多聚嘧啶序列结合蛋白的表达、纯化及其与HBV转录后调节元件RNA结合的分析: 2008年; 目的在大肠埃希菌中表达并纯化多聚嘧啶序列结合蛋白(polypyrimidine tract binding protein,PTB)-His融合蛋白,并鉴定PTB与HBV转录后调节元件(HBV posttranscriptional regulatory element,HPRE)RNA的体外结合。方法构建PTB-His融合蛋白的原核表达载体,经IPTG诱导表达后,用亲和层析的方法进行纯化。用磁珠结合与Western印迹的方法,验证PTB与HPRE RNA在体外的特异性结合。结果成功构建了PTB-His融合蛋白的原核表达载体,并在体外大量表达后用亲和层析的方法得到了高纯度的PTB-His融合蛋白。磁珠结合沉淀与Western印迹实验证明PTB与HPRE RNA在体外能特异性的结合。结论体外表达的PTB融合蛋白能与HPRE RNA特异性的结合。; 程丽英李毅蔡雪飞刘湘黄爱龙汤华; 关键词：原核表达载体

乙型肝炎病毒HBx蛋白抑制TTRAP启动子活性的体外研究: 2010年; 旨在探讨体外培养条件下HBx蛋白对TTRAP(TRAF and TNF receptor-associated protein)基因转录水平表达的影响。用RT-PCR及Real-time PCR检测TTRAP在HepG2细胞和HepG2.2.15细胞中的表达;构建TTRAP启动子虫荧光素酶报告质粒;分别与HBV、HBs、HBp、HBc、HBx表达质粒共转染HepG2细胞,比较虫荧光素酶活性。RT-PCR和Real-time PCR结果显示,TTRAP在HepG2.2.15细胞中的表达量分别是其在HepG2细胞中表达量的44.9%和27.8%(P<0.05)。TTRAP启动子虫荧光素酶报告质粒与HBV表达质粒共转染组的相对荧光素酶活性,与对照组相比下降了43.8%。转染HBx表达质粒组的相对荧光素酶活性与其对照组相比下降了35%,而转染HBc、HBs及HBp表达质粒组对相对荧光素酶活性没有影响。因此证实HBx蛋白能抑制TTRAP启动子活性。; 张小花张磊田园园王丽英黄爱龙汤华; 关键词：HBX蛋白启动子活性 HEPG2.2.15细胞 HEPG2细胞

多聚嘧啶序列结合蛋白抑制HBV转录后调节元件的功能: 2009年; 目的探讨多聚嘧啶序列结合蛋白(polypyrimidine tract binding protein,PTB)对乙型肝炎病毒转录后调节元件(HBV posttranscriptional regulatory element,HPRE)功能的影响。方法采用pDM138-HPRE CAT(chloramphenicol acetyltransferase)报告体系,通过质粒瞬时转染细胞的方式来探讨PTB对HPRE功能的影响。结果CAT活性检测表明:PTB的过表达使HPRE介导的CAT表达活性下降,并且呈剂量依赖性。当去除质粒上游剪接供体位点时,PTB仍然可以降低CAT的活性。结论PTB抑制HPRE的功能,并且这种抑制作用不依赖于上游剪接供体位点。; 程丽英万涛黄婷婷蔡雪飞张文露黄爱龙汤华; 关键词：乙型肝炎病毒瞬时转染

嘌呤霉素抗性基因捕获载体的构建及在细胞中的功能验证被引量：1: 2009年; 目的构建具有嘌呤霉素抗性基因捕获载体，扩大基因捕获载体的应用范围。方法用经改造的捕获载体（gene trapping vector）稳定转染HepG2．2．15肝癌细胞系，经嘌呤霉素筛选，制作单克隆细胞株。用PCR方法验证该载体的在细胞染色体中的整合，ELISA方法证明捕获载体捕获基因后的细胞的功能改变。结果嘌呤霉素抗性基因捕获载体整合在HepG2．2．15肝癌细胞的染色体上，并能影响细胞HBsAg和HBeAg的分泌。结论新构建的嘌呤霉素抗性基因捕获载体能在具有G418抗性的细胞中捕获有意义的目的基因。; 黄婷婷田园园张磊张小花万涛黄爱龙汤华

HBx及HBs调节RhoC启动子机制的研究: 2012年; 目的探讨HBx（hepatitis B virus X protein）及HBs（hepatitis B virus S protein）对RhoC启动子的作用机制，分析可能相互作用的启动子调控元件。方法构建RhoC启动子截短突变克隆，双荧光素酶报告分析系统（the dual-luciferase reporter assay system）检测RhoC启动子相对荧光素酶活性，通过分析启动子相对活性变化进而筛寻到起调控作用的启动子区段。过表达Ets-1转录因子，检测RhoC启动子相对荧光素酶活性。结果①成功构建了5个RhoC启动子截短变异克隆。②分别在HepG2细胞和HepG2.2．15细胞中验证了RhoC截短变异启动子活性，确定了起关键作用的启动子区段（-491bp～-320bp、-124bp～-58bp）。③HepG2细胞中分别过表达HBx及HBs，发现启动子区段-491bp～-320bp及-187bp～-124bp可以被HBx及HBs调控。④文献检索结合软件分析这些启动子区段序列，找到了高度相关的转录因子Ets-1、NF-κB、Sp1等。⑤荧光素酶检测和Real-time PCR初步验证了转录因子Ets-1对RhoC的调控作用。结论HBx及HBs可能通过Ets-1等转录因子调控RhoC启动子进而上调RhoC启动子活性。; 秦栋栋李凯曲嘉琳王森邹程程盛艳蕊汤华; 关键词：HBX HBS RHOC 启动子

利用Cre-LoxP置换系统在肝癌细胞系中稳定表达HBV的P抗原蛋白: 2008年; 利用基因诱捕载体整合到人类肝癌细胞系SMMC7721细胞的染色体基因中,得到永久性高表达诱捕载体报告基因X-gal的阳性克隆,再用Cre-LoxP置换系统,将构建好的HBV-P全长片段与诱捕载体的报告基因部分交换,HBV-P全长片段完整的整合在SMMC7721细胞的染色体基因中,得到了稳定表达HBV-P蛋白的细胞系。该细胞系为制备、纯化P抗原和研究HBV-P的基因调控提供了实验材料。; 李毅张小花张文露刘湘杨琴黄爱龙汤华; 关键词：CRE-LOXP

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