国家自然科学基金(30771898)
- 作品数：11 被引量：36H指数：3
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- 1例急性乙型肝炎患者HBV特异性CD8 T细胞的快速诱导扩增被引量：2
- 2008年
- 目的鉴定急性乙型肝炎患者HBV特异性CD8 T淋巴细胞识别的优势表位并建立对其进行快速诱导扩增的方法,为研究HBV抗原特异性CD8 T细胞的功能奠定基础。方法从1例HLA-A2阳性的急性乙型肝炎患者外周血分离外周血单个核细胞（PBMC）,使用针对HLA-A2限制性HBsAg表位（S181-181、S335-343）和HBcAg表位（C18-27）的3种HLA-A2/抗原肽荧光标记五聚体试剂（Pentamers）检测HBV特异性CD8 T细胞频率,筛选可能的优势表位。用细胞因子和相应的抗原多肽对PBMC进行1-2周刺激培养,用Pentamers检测特异CD8 T细胞,动态分析特异性CD8 T细胞的增高并用流式细胞仪对其进行分选。结果经过抗原多肽刺激并在合适条件下培养后,HBV特异性T细胞频率显著增高,培养2周时达到高峰,S183-191特异性T细胞从0.21%增高到15.17%,升高了73.8倍；S335-343特异性T细胞占总CD8 T细胞的高分比从0.44%增高到1.79%,升高了3.1倍；但C18-27特异性T细胞的频率很低且刺激培养后无明显升高。结论通过HBV多肽诱导在适当条件下可使抗原特异性CD8 T细胞在短期内获得明显诱导扩增,S-183-191特异性T细胞在控制急性HBV感染中可能具有重要作用。
- 王琳范振平李乐叶海燕高蓉张玲霞徐东平
- 关键词：肝炎乙型表位
- 乙型肝炎病毒的病毒学特点及其临床意义被引量：18
- 2009年
- 乙型肝炎病毒(HBV)为嗜肝双链DNA病毒,病毒基因组特点如下:①病毒的多聚酶/反转录酶(RT)缺乏校对功能,使HBV较其他DNA病毒更易产生变异;②病毒基因组开放读码框架重叠,1个基因位点上的突变有可能同时引起2种病毒蛋白突变;③生命周期中存在稳定的共价闭合环状DNA(cccDNA);④可以整合到宿主细胞染色体DNA中;⑤病毒蛋白对某些宿主细胞基因表达具有反式调节作用。HBV的这些病毒学特点与乙型肝炎的慢性化和疾病进展密切相关。多位点检测HBVRT基因耐药突变对临床监测病毒耐药、合理进行抗病毒治疗十分重要,分析病毒基因组变异和检测cccDNA对深入了解HBV致病机制与疗效评价有积极意义。技术方法的创新与改进是进行HBV临床病毒学特点研究的基础。
- 徐东平
- 关键词：突变抗病毒药
- 乙型肝炎患者HBV前S/S蛋白特异性CTL表位变异分析被引量：4
- 2009年
- 目的比较慢性重型乙型肝炎(CSHB)与慢性乙型肝炎(CHB)患者HBV前S/S蛋白特异性细胞毒性T细胞(CTL)表位变异的差异,探讨乙型肝炎重症化和慢性化的机制。方法对262例乙型肝炎患者的血清样本进行HLA-A2分型;用巢式PCR扩增血清HBV前S/S基因并对PCR产物进行序列测定;根据HBV前S/S基因序列,用VirusBlast软件鉴定患者感染的HBV基因型;用VectorNTI软件对目前已知的13个HLA-A2限制性前S/S蛋白特异性CTL表位进行序列分析。结果123例(46.9%)患者HLA-A2阳性,其中CSHB71例,CHB52例。CTL表位变异分析结果如下:(1)两组间所有患者进行比较,患者S177-185和S338-347表位变异发生率有显著差异(P<0.05);(2)两组间HBVB基因型患者进行比较,患者S131-139、S183-191和S204-212表位变异发生率有极显著差异(P<0.01);(3)两组间HBVC基因型患者进行比较,CSHB组患者的S131-139表位较CHB组患者有增高(P=0.05)。结论某些HBV前S/S蛋白特异性CTL表位在CSHB与CHB患者间变异有明显差异,受病毒基因型影响,CTL表位变异可能与乙型肝炎的重症化和慢性化机制相关。
- 许智慧任晓强刘妍王耀李晓东戴久增李乐姚增涛钟彦伟徐东平
- 急性乙型肝炎患者HBV特异性CD8^+ T细胞受体α和β链亚家族特点被引量：3
- 2010年
- 目的:分析急性乙型肝炎患者HBV特异性CD8+ T细胞受体α和β链亚家族特点。方法:从1例HLA*0201的急性乙型肝炎患者的外周血分离外周血单个核细胞(PBMC),用乙肝抗原HBsAg表位S335-343多肽和细胞因子刺激PBMC以诱导CD8+ T增殖,用流式细胞仪分选出特异性CTL到96孔培养板,培养10～14 d后,提取细胞RNA,PolyA介导反转录,巢式PCR扩增TCR Vα和TCR Vβ,并用非特异性CD8+ T细胞作为对照。对扩增产物分别进行直接测序和克隆测序分析。结果:从HBV急性肝炎患者分离的HBsAg335-343表位特异性CD8+ T细胞扩增出15个Vα亚家族和10个Vβ亚家族,其中用少量CTL仅检出Vα2、Vα9和TCR Vβ3、Vβ4、Vβ9,提示这几种亚家族可能为该特异性CTL TCR的优势取用亚家族,除Vα2呈现3种序列和Vβ9呈现2种序列外,其他亚家族内序列单一;而从患者非特异性CD8+ T对照细胞中可扩增到所有的32个TCRVα和25个Vβ亚家族,且同一亚家族序列呈现高度多样性。结论:急性乙型肝炎患者HBV特异性CD8+ T细胞受体存在优势利用的特点,可能是由于针对同一抗原的特异性CD8+ T细胞克隆性增殖所致,其机制有待进一步分析。
- 叶海燕王琳丁宁范振平刘妍钟彦伟刘永明徐东平
- 关键词：T细胞
- 慢性乙型肝炎患者HBV核心区与聚合酶区特异性CTL表位变异分析被引量：1
- 2011年
- 目的比较急性乙型肝炎、慢性乙型肝炎与慢性重型乙型肝炎患者HBV C蛋白和Pol蛋白特异性CTL表位变异的差异,以探讨乙型肝炎重症化和慢性化的可能机理。方法对516例乙型肝炎患者的血清进行HLA-A2和A11分型;用巢式PCR扩增血清HBV C基因与Pol基因并对PCR产物进行序列测定;根据HBV S基因序列,用VirusBlast软件鉴定患者感染的HBV基因型;用Vector NTI软件对目前已知的HLA-A2限制性的4个C蛋白和5个Pol蛋白特异性CTL表位与HLA-A11限制性的1个C蛋白表位进行序列分析。结果 247例(47.86%)患者HLA-A2阳性,其中AHB 67例,CHB 109例,CSHB 71例;220例(42.64%)患者HLA-A11阳性,其中AHB 67例,CHB 107例,CSHB 46例;CTL表位变异分析结果如下:①在3组HLA-A2阳性患者,表位变异发生率无显著性差异(P>0.05);②在三组HLA-A2阳性HBV B基因型患者,P455-463和P816-824表位变异有极显著性差异(P<0.01);③在三组HLA-A2阳性HBV C基因型患者,各表位变异无显著性差异;④在三组HLA-A11阳性患者,C88-96表位变异发生率有显著性差异(P<0.05),三组HBV C基因型患者,表位变异发生率有极显著性差异(P<0.01),而在HBV B基因型患者,各表位变异无显著性差异(P>0.05)。结论某些HBV C蛋白和Pol蛋白特异性CTL表位在AHB、CHB和CSHB患者间变异有明显差异,并且受感染病毒基因型的影响。CTL表位变异可能与乙型肝炎的重症化和慢性化机制相关。
- 许智慧任晓强刘妍李晓东王耀戴久增徐东平
- 关键词：乙型肝炎乙型肝炎病毒核心蛋白
- 急性乙肝患者HBV特异性CD8T细胞受体基因的克隆分析被引量：2
- 2011年
- 目的探讨急性乙肝患者HBV特异性CD8 T细胞受体（TCR）参与免疫应答的分子机制。方法分离HLA-A2阳性急性乙型肝炎患者外周血单个核细胞（PBMCs）,用荧光标记的CD3、CD8抗体和五聚体染色,流式细胞仪检测HBsAg183-191和HB-sAg335-343特异性CD8 T细胞频率。取6例患者PBMCs,用HBsAg335-343表位多肽诱导培养34周,用磁珠分选出CD8 T细胞后再用流式细胞术分选HBV特异性CD8 T细胞,经IL-2/CD3抗体/CD28抗体扩增后提取细胞mRNA,用cDNA5′末端快速扩增技术获取TCR分子α链和β链全长可变区基因片段并进行克隆和测序,每个样本的克隆测序数≥50个。确定TCRα、β链基因家族并比较CDR3区序列特点。结果 6例患者样本600多个TCRα、β链克隆基因序列分析结果表明,HBV特异性CD8 T细胞均呈现TCR分子α、β链基因家族优势表达特点,每例患者样本以24种α链和14种β链家族为主,其中α2、α14、α15、β3、β13和23链家族同时出现在1例以上患者,有1例患者所有克隆分析的β链基因均为β13家族。同一患者同一家族α、β链CDR3区序列趋于一致,而不同患者同一家族α、β链CDR3区序列相差较大。结论经HBV抗原表位多肽诱导增殖的特异性CD8 T细胞具有明显的TCRα、β链取用优势特点,这种TCR链的优势表达特点可能是影响抗HBV感染特异性细胞免疫力的重要分子基础。
- 丁宁叶海燕刘妍范振平黄丽利赵平靳雪源邹正升徐东平
- 关键词：乙型急性受体
- 一种高效扩增人T细胞受体β链可变区基因的方法建立被引量：2
- 2009年
- 目的:建立一种高效扩增人T细胞受体(TCR)β链可变区(Vβ)基因的方法。方法:根据TCRVβ26个亚家族基因序列特点设计扩增Vβ基因的上游内引物34条、上游外引物37条,并将内、外上游引物各分为8个简并组。在恒定区(C区)设计下游内、外和测序引物各1条以及扩增Cβ基因的上游引物1条。提取细胞RNA,用PolyA介导反转录后,采用巢式PCR扩增正常人CD8T细胞TCRVβ26个亚家族基因,并用JurkatT淋巴瘤细胞作为对照。用T-easy载体克隆RT-PCR产物,对克隆基因进行测序。结果:从正常人的CD8T细胞中扩增到所有TCRVβ亚家族基因,克隆后测序与相应的参考序列同源。从Jurkat细胞扩增出TCRVβ8基因,经测序验证与文献报道一致,且最少可从10个细胞提取的RNA模板中扩增成功。结论:建立的巢式RT-PCR方法可以高效、广谱地扩增人TCRVβ基因,为进一步进行抗原特异性细胞毒T淋巴细胞的TCR克隆和功能研究打下了良好基础。
- 叶海燕王琳范振平钟彦伟苏何玲刘永明徐东平
- 关键词：CD8T细胞反转录PCR
- 一种高效扩增人T细胞受体α链可变区基因方法的建立被引量：3
- 2009年
- 目的建立一种高效扩增人T细胞受体(TCR)α链可变区(Vα)基因的方法。方法根据TCR Vα32个亚家族的基因序列特点,设计扩增Vα基因的上游内、外引物各42条,并将上游内、外引物各分为5组简并引物。在恒定区(C区)设计下游内、外引物,测序引物以及扩增Cα基因的上游引物各1条。提取细胞RNA,用PolyA介导反转录后,采用巢式PCR扩增正常人外周血单个核细胞(PBMC)中CD8 T细胞TCR Vα的32个亚家族基因,以Jurkat T淋巴瘤细胞作为对照。用T-easy载体克隆RT-PCR产物,对克隆基因进行测序分析。结果从正常人CD8 T细胞中扩增到了所有TCR Vα亚家族基因,以10个Jurkat细胞所提取的RNA作为模板即可获得成功扩增。TCR Vα同一亚家族基因的同源性均大于75%,序列差异主要在CDR3高变区。结论建立了一种高效灵敏的TCR Vα编码基因扩增方法,为抗原特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)的TCR克隆和功能研究打下了良好基础。
- 王琳叶海燕李晓东刘妍范振平张玲霞徐东平
- 关键词：T淋巴细胞
- 转基因表达HBV抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞受体被引量：2
- 2013年
- 目的通过逆转录病毒介导HBV抗原特异性细胞毒性T细胞(CTL)的T细胞受体(TCR)转基因表达,初步观察其结合活性。方法从HLA-A2阳性急性乙肝患者外周血中诱导、分选、克隆和扩增HBV抗原特异性CTL;提取细胞RNA,用RT-PCR、5'-RACE和OVER-LAP PCR等方法获取TCR的α和β链编码基因;构建TCR重组逆转录病毒,介导特异性TCR分别在人Jurkat T细胞和HLA-A2阳性健康人CD8 T淋巴细胞上表达。结果从1例HLA-A2阳性急性乙肝患者样本中分别获得了2组TCR Vα、Vβ配对,分别命名为α21β13、α15β13,包装的重组逆转录病毒滴度为(1.5～5.0)×105IU/mL,用针对目标TCR的特异性Vβ链抗体(抗Vβ13 TCR-PE)和HLA-A2限制性表位特异性五聚体(pentamer)进行免疫荧光染色,重组TCR在T细胞表面获得表达:其中在Jurkat细胞上转入的Vβ13链表达细胞占1.06%～2.25%,在HLA-A2阳性健康人T细胞上Vβ13阳性细胞和pentamer阳性细胞分别占到1.03%～2.06%和1.05%～1.12%,在HLA-A2阴性健康人T细胞上Vβ13阳性细胞和pentamer阳性细胞均低于0.05%。结论通过逆转录病毒介导可以使HBV特异性CTL TCR获得转基因表达,具有结合HLA-A2限制性表位的活性。
- 吴静王琳刘妍叶海燕丁宁刘永明徐东平
- 关键词：细胞毒性T淋巴细胞T细胞受体
- 乙肝患者HBV特异性细胞毒T淋巴细胞的分析被引量：5
- 2011年
- 目的分析急性乙肝患者外周血中HBV特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)的表达特点及其在免疫应答机制中的作用。方法采集2008年10月-2010年6月于解放军302医院就诊的40例急性乙肝患者血样进行人白细胞抗原-A2(HLA-A2)检测,对其中18例HLA-A2阳性患者取病程极期及恢复期外周血,分离单个核细胞,并以6例HLA-A2阴性急性乙肝患者、18例HLA-A2阳性慢性乙肝患者和6例HLA-A2阳性健康正常人作为对照,经CD3、CD8单克隆抗体和HBV多肽抗原(HBsAg183-191,HB-sAg335-343)特异性五聚体(pentamer)染色后,采用流式细胞仪检测HBV特异性CTL频率,Cell-quest软件分析结果。同时检测患者发病极期丙氨酶转氨酶(ALT)峰值及HBV DNA载量,并进行相关性分析。结果 18例HLA-A2阳性急性乙肝患者急性期HB-sAg183-191的特异性CTL频率为0.23%±0.18%,HBsAg335-343特异性CTL频率为0.49%±0.31%,较HLA-A2阳性慢性乙肝患者发病极期上述抗原的特异性CTL频率(分别为0.07%±0.03%和0.08%±0.04%)明显升高(P<0.01);HBsAg183-191的特异性CTL频率与ALT峰值无显著相关性(r=0.4506,P=0.0528),而HBsAg335-343特异性CTL频率与ALT水平呈正相关(r=0.5642,P=0.0119),但上述CTL频率均与乙肝病毒载量无明显相关。与发病极期相比,患者在恢复期HBsAg335-343特异性CTL频率明显降低(P=0.011)。HLA-A2阴性急性乙肝患者及HLA-A2阳性正常人均未检出上述2种抗原的特异性CTL。结论 HBV特异性CTL在病毒清除和肝损伤中具有重要作用,针对不同HBV抗原表位的CTL,其作用可有一定差别。
- 丁宁黄丽利刘妍范振平刘立明赵平靳雪源叶海燕徐东平
- 关键词：HLA抗原
