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改进MSAP-PCR技术应用于Cd胁迫下拟南芥DNA甲基化分析被引量：5: 2015年; 全基因组DNA甲基化分析是植物胁迫表观遗传损伤研究的主要方向之一,目前可用手段虽多,然而多数较繁琐,不利于表观遗传损伤的快速诊断。为此应用MSAP-PCR法研究Cd胁迫下拟南芥基因组甲基化变化,并通过优化实验条件、筛选引物(共5条,包括通用引物MLG2和本实验室设计引物AP-1、AP-2、AP-3、AP-4)以及检验多态性和敏感性,综合评估该方法在植物甲基化研究中的应用前景。研究结果发现:该方法模板量选择在150~250 ng并使用4%聚丙烯酰胺凝胶电泳(含50%尿素)分辨PCR产物多态性最佳;该方法对镉敏感性高,在0.2 mg·L-1Cd2+水平就可检测约30个位点的甲基化多态性;引物AP-4对Cp G位点甲基化变化最敏感,而AP-3对CHG位点甲基化变化敏感性最高。该方法操作简便、成本低廉、结果准确且敏感性高,可作为植物全基因组甲基化研究的理想方法,以及植物抗逆研究和环境污染早期诊断的生物胁迫标记物。; 王鹤潼何蕾宋杰孙梨宗崔伟娜台培东贾春云刘宛; 关键词：拟南芥生物标记物

改进亚硫酸盐测序技术研究拟南芥DNA甲基化水平被引量：1: 2013年; DNA胞嘧啶甲基化是一种重要的表观遗传修饰形式,在细胞增殖、分化、发育、基因组印迹、基因表达调控等过程中起着重要作用。随着对DNA甲基化研究的深入,各种DNA甲基化检测方法被开发出来满足不同类型的研究需求。通过实验建立的一种改进亚硫酸盐测序技术,将拟南芥基因组DNA经酶切纯化后,用亚硫酸盐修饰液修饰,将PCR产物克隆到pEASY-T1载体上,每个样品随机挑取15个阳性克隆,测序分析,研究拟南芥错配修复基因MutL-homologue 1(MLH1)启动子区域的甲基化水平。结果表明:与传统亚硫酸盐测序法相比,改进方法有利于DNA完全修饰,既减少了修饰时间,又提高了PCR目的片段的特异性、稳定性和重复性;MLH1基因启动子区域甲基化比率为27.3%,而不是45.6%,避免了非甲基化位点的错认。为植物DNA甲基化分析提供了一种更为理想的研究手段。; 马珊珊孙晓霞李照令贾春云刘宛台培东赵晓辉李培军; 关键词：DNA甲基化 MLH1

运用MSAP研究镉胁迫对拟南芥幼苗基因甲基化的影响被引量：18: 2014年; DNA甲基化是表观遗传学的重要组成部分,并在环境胁迫响应中起重要作用。运用甲基化敏感扩增多态性(Methylation sensitive amplification polymorphism,MSAP)技术研究0、0.5、1.5、5.0 mg·L-1Cd2+处理对拟南芥幼苗全基因组DNA甲基化水平的影响,结果表明:(1)不同浓度镉处理19 d后,叶片数、地上部鲜重无明显变化,但根长受到显著抑制;(2)选取10对引物扩增DNA酶切产物,所得三个镉处理造成的拟南芥基因组MSAP%均高于对照(35%);(3)随着镉处理的增大,拟南芥基因组甲基化(M)型条带依次减少,去甲基化(D)型条带逐渐增加,并且条带亮度也有所变化;(4)将特异性条带克隆测序后发现,mRNA、假设蛋白、表达蛋白、用于编码假定蛋白的mRNA序列V型质子ATP酶亚组、叶绿体中光合体系II CP47基因、叶绿体DNA、rRNA重复单元、核糖体蛋白等多种序列均存在甲基化修饰现象。这些特异序列可为我们寻找镉胁迫的生物标记物及胁迫响应的机理研究提供一定的依据。; 李照令王鹤潼陈瑞娟贾春云贾春云李晓军台培东李培军; 关键词：拟南芥镉胁迫 MSAP

铜胁迫对拟南芥幼苗生长和基因组DNA甲基化的影响被引量：9: 2015年; 通过Murashige and Skoog（M＆S）培养实验,利用甲基化敏感扩增多态性（methylation-sensitive amplified polymorphism,MSAP）技术研究Cu2＋胁迫对拟南芥幼苗基因组DNA甲基化水平与甲基化模式的变化,同时比较其与幼苗鲜重、根系生长对Cu2＋胁迫的敏感性。结果表明：0、0.25、1.0 mg獉L-1Cu2＋处理15 d后,幼苗根长及鲜重变化差异不显著,而幼苗基因组MSAP率随Cu2＋浓度的增加呈先增高后降低的趋势,分别为15.93%、16.28%和15.83%;高浓度Cu2＋胁迫下（3.0 mg獉L-1）,根长显著变短,鲜重显著降低,MSAP率为14.26%;Cu2＋胁迫（0.25~3.0 mg獉L-1）下,拟南芥幼苗基因组超甲基化（M型）位点及去甲基化（D型）位点数均呈显著增加趋势,Msp I酶较Hpa II酶对胁迫反应更敏感。因此,拟南芥幼苗MSAP变化对低浓度Cu2＋胁迫响应敏感,可作为Cu污染的早期诊断和生态风险评价。; 陈瑞娟何蕾孙梨宗王鹤潼宋婕刘宛; 关键词：DNA甲基化拟南芥 CU胁迫

Cu胁迫对拟南芥幼苗错配修复基因表达的影响被引量：2: 2013年; 采用半定量反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,以18SrRNA为内参基因,研究了Cu胁迫对拟南芥(Arabidopsis thaliana)幼苗错配修复相关基因(MLH1、MSH2、MSH3、MSH6、MSH7)表达的影响,并结合幼苗的形态和生理指标,选取Cu胁迫敏感的生物标记物。结果表明,Cu处理10d后,对拟南芥种子发芽率、地上部鲜重及叶绿素含量的影响不大;根的长度明显受到抑制;拟南芥幼苗地上部可溶性蛋白质含量随着Cu浓度增加明显降低;5个错配修复相关基因的表达均受到不同程度的抑制,Cu浓度与拟南芥幼苗上述指标之间存在明显的剂量-效应关系。以上结果表明,地上部可溶性蛋白含量变化与上述错配修复相关基因表达量的改变趋势一致,且均对Cu胁迫较敏感,可以作为检测Cu污染对植物遗传毒性效应的生物标记物。; 孙晓霞宋有涛李照令刘宛台培东李培军; 关键词：生物标记物错配修复基因半定量RT-PCR

镉、铜胁迫下拟南芥基因组DNA甲基化的MSAP分析被引量：6: 2013年; [目的]研究不同浓度Cd、Cu胁迫下拟南芥幼苗基因组DNA的甲基化水平和状态变化。[方法]以0、0.5和5.0 mg/L Cd2+、0.5和5.0 mg/L Cu2+处理21 d的拟南芥为材料,提取基因组DNA,进行甲基化敏感扩增多态性(methylation sensitive amplification polymor-phism,MSAP)分析。[结果]0、0.5 mg/L Cd2+、5.0 mg/L Cd2+、0.5 mg/L Cu2+和5.0 mg/L Cu2+处理组DNA的MSAP比率分别为30.2%、34.7%、41.0%、33.9%、39.2%。0.5 mg/L Cd2+、5.0 mg/L Cd2+、0.5 mg/L Cu2+、5.0 mg/L Cu2+处理组的DNA甲基化多态性比例分别为2.6%、13.2%、2.4%、11.2%。[结论]Cd、Cu胁迫下拟南芥基因组DNA甲基化水平的增加及DNA甲基化多态性的提高与Cd、Cu处理浓度呈显著正相关,且Cd对DNA甲基化水平和多态性改变的作用大于Cu。; 赵晓辉徐正进刘宛王鹤潼李照令马珊珊孙晓霞; 关键词：拟南芥 DNA甲基化镉胁迫铜胁迫 MSAP

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辽宁省自然科学基金(201202224)