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LRP16短发夹RNA慢病毒载体的构建及LRP16稳定抑制细胞的建立: 2014年; 目的:构建靶向LRP16基因的短发夹RNA(shRNA)慢病毒表达载体,鉴定其在HeLa细胞中对LRP16的抑制效果。方法:构建pWPT-U6-LRP16shRNA-CMV-GFP慢病毒载体,通过病毒感染、细胞筛选、Western印迹等步骤,获得LRP16基因稳定抑制的细胞株。结果:构建了具有LRP16干扰效果的慢病毒载体,感染HeLa细胞后获得了稳定沉默LRP16及对照的细胞株;经克隆筛选,在荧光显微镜下观察到近似100%感染细胞发出绿色荧光;Western印迹证实pWPT-U6-L374-CMV-GFP和pWPT-U6-L668-CMV-GFP均可显著抑制HeLa细胞株中LRP16蛋白的表达,其中pWPT-Gsi-L374-GFP的抑制效果更好。结论:构建了靶向人LRP16基因shRNA慢病毒载体及LRP16稳定抑制的HeLa细胞系。; 王春萌柏苗苗伍志强李小雷李祥梅倩韩庆旺韩为东; 关键词：LRP16 HELA细胞慢病毒载体

LRP16转基因小鼠的繁殖与鉴定: 2014年; 目的繁殖和鉴定携带有外源LRP16基因的转基因小鼠,为体内研究LRP16的生物学功能提供动物模型。方法首先将构建好的LRP16转基因重组质粒转染到293T细胞,鉴定该质粒是否可以有效表达目的蛋白,随后利用原核显微注射方法将线性化的重组质粒注射入品系为FVB的小鼠受精卵中,获得F0代小鼠。应用PCR方法对F0代小鼠进行鉴定,并将阳性F0代小鼠继续繁殖。结果 LRP16转基因重组质粒在293T细胞中可以有效表达,经PCR鉴定获得3只阳性F0代小鼠,阳性率为6.23%,选取其中1只整合有LRP16基因的F0代雄鼠,通过其与野生型FVB小鼠杂交获得7只F1代子鼠,其中4只为阳性鼠,阳性率为57.14%。从F1代中再次选取其中1只阳性雄鼠与野生型小鼠杂交繁殖获得5只F2代子鼠,PCR鉴定结果显示2只为阳性,阳性率为40%。结论 LRP16基因成功整合到小鼠基因组中,并且能够稳定遗传,为后续在动物整体水平研究LRP16的功能奠定了基础。; 王春萌柏苗苗伍志强李小雷李祥梅倩韩为东; 关键词：LRP16基因转基因小鼠繁殖基因鉴定

Gateway技术构建转基因重组质粒pRP.EX3d-EF1A-LRP16-His-IRES-eGFP: 2014年; 目的构建转基因重组质粒pRP.EX3d-EF1A-LRP16-His-IRES-eGFP,为转基因鼠的建立奠定基础。方法利用重叠PCR技术扩增attB1-LRP16-His-attB2,经BP反应,将LRP16基因插入到载体pDown上,pUp-EF1A、pDown-LRP16-His、pTail-IRES-eGFP和PRP.Des3d经LR反应,将LRP16转移到pRP.EX3d上,转化Stbl3细胞,用氨苄西林进行抗性筛选,经PCR鉴定后将阳性克隆送测序。结果测序及酶切结果验证获得正确的pRP.EX3d-EF1A-LRP16-His-IRES-eGFP重组质粒。结论成功构建pRP.EX3d-EF1A-LRP16-His-IRES-eGFP重组质粒,可用于下一步LRP16转基因小鼠的构建。; 柏苗苗王春萌伍志强梅倩李小雷李祥赵亚力韩为东; 关键词：LRP16 GATEWAY技术 LRP16

LRP16结合poly(ADP-ribose)关键位点的识别: 2013年; LRP16作为macro domain家族成员,可识别、结合poly(ADP-ribose),参与DNA损伤修复的早期反应.但究竟LRP16通过其何种氨基酸位点识别、结合poly(ADP-ribose)(PAR)尚不十分清楚.本研究首先通过对LRP16蛋白的结构分析,查找LRP16结合PAR的候选氨基酸位点,然后利用丙氨酸扫描技术构建系列LRP16(点)突变体,并且进行原核蛋白表达与纯化,将获得的蛋白质进行斑点杂交实验,检测LRP16突变体蛋白与PAR的结合活性.测序结果显示,LRP16点突变基因序列成功插入到原核表达载体pGEX-6p-1中;斑点杂交实验显示,LRP16中第160位D和第161位I突变成A后,其与PAR结合能力明显减弱,而第181位G、183位V、184位D同时突变为A,LRP16与PAR的结合活性有部分减弱.结果表明,LRP16中第160位和第161位的氨基酸是其与PAR结合的关键位点.; 柏苗苗王春萌伍志强梅倩李小雷李祥赵亚力韩为东; 关键词：LRP16

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北京市科技新星计划(2011113)