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Anti-HER2 ScFv-GFP融合蛋白在大肠杆菌中的表达及其靶向结合乳腺癌细胞的初步分析被引量：2: 2011年; 目的:构建原核表达系统诱导获得携带绿色荧光的抗人表皮生长因子受体2(human epidermalgrowth factor receptor 2,HER2)单链抗体,分析其靶向结合HER2阳性肿瘤细胞的功能,探讨其应用于HER2阳性肿瘤分子诊断与靶向治疗的可能性。方法:将绿色荧光蛋白基因与鼠源性人抗HER2单链抗体基因拼接成融合基因anti-HER2 ScFv-GFP,构建原核表达载体重组子pBAD His B/anti-HER2-ScFv-GFP,转入大肠杆菌E.coli TOP10诱导表达,SDS-PAGE和Western Blot法鉴定,Ni2+-NTA亲和层析法纯化获得目的融合蛋白。将不同浓度的融合蛋白anti-HER2 ScFv-GFP分别与HER2阳性的乳腺癌细胞SKBR3、HER2阴性的MCF7混合,观察绿色荧光在不同癌细胞表面的分布。结果:成功获得长度为1 539 bp的融合基因,原核表达系统pBAD His B/anti-HER2-ScFv-GFP/TOP10成功构建并表达携带绿色荧光的抗HER2单链抗体,融合蛋白相对分子量大小约60 kDa。HER2阳性的SKBR3细胞表面有明显绿色荧光,细胞有皱缩现象,而HER2阴性MCF7被洗脱后无荧光。结论:携带绿色荧光的抗HER2单链抗体能牢固结合在HER2阳性的乳腺癌细胞SKBR3表面,绿色荧光可以起到报告作用。; 高国辉黄奇迪王金丹杨水兵杨娟张凤立胡孝渠; 关键词：绿色荧光蛋白融合蛋白

Anti-HER2-ScFv-GFP融合蛋白靶向结合体外乳腺癌细胞表面受体的研究被引量：2: 2011年; 为了研究不同表达系统获得的携带绿色荧光抗HER2单链抗体(Anti-HER2-ScFv-GFP)是否既可靶向结合HER2阳性乳腺癌细胞表面,也可通过观察绿色荧光变化直接判断抗体结合乳腺癌细胞表面后细胞的动态变化,在前期成功构建两种表达系统的基础上,利用Ni^(2+)-NTA亲和层析法纯化来源于真核表达系统pFAST Bac to Bac HT A/Tn-5B1-4和原核表达系统pBAD His B/TOP10的融合蛋白Anti-HER2-ScFv-GFP,设置HER2阳性细胞SKBR3为实验组、HER2阴性细胞MCF7为对照组,分别与之混合24 h后,1×PBS洗脱细胞3次,激光共聚焦显微镜观察到两种不同表达系统获得的融合蛋白在HER2阳性细胞SKBR3表面分布均有绿色荧光,真核表达的蛋白结合效率明显高于原核表达的蛋白,SKBR3结合高浓度的融合蛋白后细胞表现出皱缩,绿色荧光明显增强,而两种不同来源的融合蛋白与HER2阴性MCF7混合后均易被洗脱。GFP标准品与SKBR3混合后也容易被洗脱。实验表明构建的携带绿色荧光抗HER2单链抗体同时具有靶向结合和报告作用两方面的功能。; 高国辉黄奇迪王金丹杨纪锋包兵兵胡孝渠

Anti HER2 ScFv-GFP融合抗体靶向检测HER2的表达被引量：2: 2012年; 为验证真核表达的携带绿色荧光的抗HER2单链抗体应用于临床诊断HER2阳性肿瘤细胞和病理组织的可靠性,构建融合基因Anti HER2 ScFv-GFP,重组入pFAST Bac HT A载体,在昆虫细胞Sf9中表达,以Ni2+-NTA亲和层析法纯化Anti HER2 ScFv-GFP融合蛋白,测定其浓度与纯度,将同浓度的纯化蛋白分别与3种乳腺癌细胞BT474、SKBR3和MCF7各混合12 h、24 h和48 h,分析其在不同时间段结合HER2阳性肿瘤细胞的稳定性。用纯化蛋白直接检测经抗原修复的乳腺癌病理组织,与免疫组织化学法检测结果对比。结果在昆虫细胞Sf9中可观察到明显绿色荧光,纯化的融合蛋白相对分子量约60 kDa,浓度为115.5μg/mL,纯度约97%,SKBR3和BT474鉴定为HER2阳性。结合12 h、24 h、48 h后其细胞表面均有明显绿色荧光,而HER2阴性MCF7被洗脱后无荧光,该抗体滴度为1:64,48 h内该荧光抗体仍具有稳定性。携带绿色荧光的融合抗体检测病理组织与IHC法的结果完全一致。表明成功表达的携带绿色荧光的抗HER2单链抗体可特异性检测HER2阳性乳腺癌细胞BT474和SKBR3,在HER2阳性肿瘤细胞和临床病理组织检测上具有应用前景。; 高国辉陈翀杨艳梅杨涵王金丹郑易黄奇迪胡孝渠; 关键词：绿色荧光蛋白分子诊断

融合蛋白anti-HER2-ScFv-GFP在昆虫细胞中的表达及其靶向结合乳腺癌细胞的功能分析被引量：3: 2011年; 目的:利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达获得携带绿色荧光蛋白(GFP)的抗人表皮生长因子受体2(HER2)的单链抗体可变区片段(ScFv),分析其靶向结合乳腺癌细胞表面受体HER2的功能。方法:构建融合基因anti-HER2-ScFv-GFP,重组获得真核表达载体重组子pFAST Bac-to-Bac HT A/anti-HER2-ScFv-GFP,转化DH10Bac,收集重组病毒bacmid,分别转染、感染粉纹夜蛾细胞Tn-5B1-4,SDS-PAGE及Westernblotting分析融合蛋白表达产物。Ni2+-NTA亲和层析法纯化anti-HER2-ScFv-GFP融合蛋白后分别滴入乳腺癌细胞HER2阳性的SKBR3和HER2阴性的MCF7,对比携带绿色荧光的抗HER2单链抗体靶向结合乳腺癌细胞表面HER2受体情况。结果:获得长度约1 539 bp的融合基因anti-HER2-ScFv-GFP,感染重组病毒的Tn-5B1-4细胞膜附近有明显绿色荧光,SDS-PAGE、Western blotting法检测到60 kD的特异性条带。结合实验显示HER2阳性的SKBR3细胞表面有明显绿色荧光,而HER2阴性的MCF7细胞表面荧光易被洗脱。结论:在Tn-5B1-4中成功表达携带绿色荧光的融合蛋白anti-HER2-ScFv-GFP,该携带绿色荧光的抗HER2单链抗体具有靶向结合乳腺癌细胞表面HER2受体的效能。; 高国辉王金丹黄奇迪杨纪峰杨水兵包兵兵张羽胡孝渠; 关键词：融合基因表达

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国家自然科学基金(30801118C160403)