国家高技术研究发展计划(2011AA100605)
- 作品数：28 被引量：152H指数：8
- 相关作者：廖志华唐克轩兰小中陈敏沈乾更多>>
- 相关机构：西南大学上海交通大学西藏农牧学院更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划国家自然科学基金教育部“新世纪优秀人才支持计划”更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生农业科学更多>>
- PMT和H6H双基因共转化提高三分三托品烷类生物碱质量分数被引量：2
- 2014年
- 三分三是我国特有的托品烷类生物碱药源植物.采用基于发根的外源基因表达技术,农杆菌介导遗传转化三分三,获得转烟草PMT和莨菪H6 H基因的发根、基因组PCR鉴定转基因发根、液体摇床培养后,HPLC检测发根中莨菪碱和东莨菪碱质量分数.结果发现:在三分三转基因发根中,能够同时检测到1 177bp的莨菪H6 H基因片段和451bp的烟草PMT基因片段,而非转基因发根没有检测到这2个基因,表明外源PMT和H6 H这2个基因整合进了三分三基因组.转基因发根系T11中东莨菪碱质量分数最高,比非转基因发根系高出近6倍,比自然根高出近25倍;转基因发根系T25中莨菪碱质量分数最高,比非转基因发根系高出近8倍,比自然根高出近75倍;转基因T25中东莨菪碱和莨菪碱总量最高,比非转基因发根系高出近7倍,比自然根高出近44倍.
- 严铮辉潘夕春强玮廖志华
- 关键词：三分三代谢工程
- 青蒿花药培养研究
- 2012年
- 研究通过对青蒿小孢子发育时期的鉴定,选取小孢子发育处于单核期的青蒿花药,将其分离后体外培养,依次经过愈伤组织诱导、愈伤组织分化、生根壮苗各个阶段获得青蒿花培植株。之后采用流式细胞术对其中11株青蒿花培植株进行了倍性鉴定,结果表明本研究建立的青蒿花药培养体系效果良好,可以通过青蒿花药培养获得单倍体青蒿植株。
- 吴韶龑唐克轩
- 关键词：青蒿花药培养单倍体流式细胞术
- 过表达HDR和ADS基因对青蒿素生物合成的影响被引量：8
- 2014年
- 青蒿素是从草本药用植物黄花蒿(Artemisia annua L.)中分离提取的一种含有过氧桥基团结构的新型倍半萜内酯,它是世界卫生组织推荐治疗脑型疟疾和抗氯喹恶性疟疾的特效药物。本研究采用过表达青蒿素生物合成途径中关键酶基因的方法,培育出青蒿素含量提高的转基因黄花蒿。采用根癌农杆菌介导遗传转化方法,潮霉素抗性筛选获得同时转化HDR和ADS两个基因的转基因黄花蒿;通过基因组PCR检测确认获得了6个共转化HDR和ADS基因的转基因株系。实时荧光定量PCR检测基因表达量,结果表明转基因株系中HDR和ADS基因表达量均高于非转基因植株(仅ah3株系ADS基因表达量没有显著性提高);HPLC测定青蒿素含量结果表明转基因株系中青蒿素含量均高于非转基因植株。青蒿素含量最高的转基因株系ah70中青蒿素含量为非转基因对照的3.48倍。本研究实验结果表明,过表达HDR和ADS基因在黄花蒿的代谢途径中具有提高青蒿素含量的作用,为进一步利用代谢工程技术培育青蒿素高产转基因黄花蒿提供了良好基础。
- 王亚雄龙世平曾利霞向礼恩林智陈敏廖志华
- 关键词：黄花蒿青蒿素
- 南方红豆杉DXS基因的克隆与功能分析被引量：8
- 2018年
- 目的从南方红豆杉Taxus chinensis获得紫杉醇生物合成途径关键酶1-脱氧-D-木糖醇-5-磷酸合成酶(1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase,DXS)基因(TcDXS)并进行生物信息学和表达模式分析以及亚细胞定位和功能鉴定。方法采用RACE技术获得TcDXS全长;利用qRT-PCR分析TcDXS在南方红豆杉不同部位的表达情况;采用亚细胞定位分析TcDXS在细胞中的位置;用颜色功能互补实验检测TcDXS功能。结果获得的TcDXS由3 031个核苷酸组成,包含了2 229 bp编码区,编码742个氨基酸,其蛋白相对分子质量为79 400,等电点(p I)为7.99;qRT-PCR检测表明TcDXS在南方红豆杉的嫩叶柄中表达量最高,其次是叶和皮,根和茎中的表达量较低;亚细胞定位结果表明,TcDXS定位在叶绿体中;功能互补实验结果表明,在共同转化p AC-BETA和pTrc-TcDXS的大肠杆菌菌落呈现出橘黄色。结论 TcDXS的克隆和功能分析为深入研究紫杉醇生物合成途径和实现其代谢工程奠定了基础。
- 王辉王辉李忠玥邱飞兰小中邱飞兰小中
- 关键词：南方红豆杉紫杉醇亚细胞定位
- 青蒿JAZ基因克隆及其功能分析被引量：4
- 2018年
- 茉莉酸(jasmonic acid,JA)能诱导青蒿素生物合成,为进一步解析青蒿JA信号通路,本研究从青蒿中克隆并鉴定2个JA信号通路中的负调控因子JAZ(jasmonate ZIM-domain)基因,分别命名为AaJAZ5和AaJAZ6。这两者均含有JAZ家族特有的保守区域ZIM和Jas。AaJAZ5在叶中表达量最高,其他部位的表达量较低;AaJAZ6在根中的表达量最高,茎中的表达量最低。茉莉酸甲酯(Me JA)和机械伤害处理都能显著提高AaJAZ5和AaJAZ6的表达。通过双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation,Bi FC)证明,AaJAZ5和AaJAZ6均能与Aa MYC2相互作用,而只有AaJAZ5与Aa COI1存在相互作用,表明AaJAZ5在JA信号通路中可能具有更加重要的作用。本研究为进一步分析青蒿JAZ家族成员的功能分化和JA信号调控青蒿素生物合成的分子机制奠定了基础。
- 夏菁夏菁曾俊岚王焕燕廖志华杨春贤
- 关键词：青蒿素JAZCOI1
- 天仙子发根诱导及碳源、氮源和磷源对发根培养的影响被引量：2
- 2016年
- 利用发根农杆菌介导的遗传转化法,诱导天仙子发根.结合组织培养技术和高效液相色谱法,改变培养基碳源种类、硝态氮和铵态氮的比例和磷源的浓度,研究其对天仙子发根生长及莨菪碱和东莨菪碱质量分数的影响.结果表明:发根诱导中,C58C1的诱导效率最高,达到84.85%.蔗糖为碳源,发根干质量生物量积累最多,莨菪碱质量分数最高;果糖为碳源,东莨菪碱质量分数最高.WPM基本培养基中,保持总氮源浓度为15mmol/L,当NO_3^-与NH_4^+的比例为2∶1时,发根在生物量积累、莨菪碱和东莨菪碱质量分数上都达到最高;而当全部为NO_3^-时,发根干质量最少且莨菪碱和东莨菪碱的质量分数最低.高浓度KH_2PO_4(5.00mmol/L)时,发根的干质量最大,低浓度KH_2PO_4(0.31mmol/L)时,莨菪碱和东莨菪碱的质量分数最高.
- 侯艳玲邱飞王辉王中平兰小中廖志华刘小强
- 关键词：天仙子发根发根农杆菌碳源磷源
- 青蒿B-BOX型锌指蛋白基因AaBBX22的克隆及表达分析被引量：2
- 2013年
- 在外界环境刺激下B-BOX型锌指蛋白基因往往可以诱导植物相关基因的应答反应抵抗逆境胁迫。为了研究青蒿中AaBBX22基因在逆境胁迫中的表达特点,我们从青蒿的cDNA文库中克隆得到了AaBBX22基因。该基因全长为1 114bp,包含1个813bp的开放阅读框。生物信息学分析表明该基因具有2个典型的B-BOX型锌离子结合位点。进化树分析显示AaBBX22与葡萄和大豆的B-BOX型基因具有较近的亲缘关系。实时荧光定量PCR结果表明,在正常生长条件下,该基因在青蒿的各个组织部位中都有表达,其在根中的表达量最高,在花蕾中的表达量最低。盐和干旱处理都能显著诱导该基因的表达,脱落酸(ABA)、甲基茉莉酸(MJ)和低温处理显著抑制了该基因的表达,伤害处理在一定程度上抑制了该基因的表达。推测AaBBX22基因可能参与青蒿的耐盐和耐旱调控。
- 高尔娣陆续沈乾唐克轩
- 关键词：青蒿克隆
- 青蒿中AaWRKY3转录因子的克隆及表达分析被引量：1
- 2013年
- 研究克隆得到了青蒿AaWRKY3基因,属Ⅱ类WRKY转录因子,其表达蛋白约为76kD。该基因在植物组织中广泛表达,在根中的表达量最高,且其表达量随叶片生长不断增加。其表达量受到低温、干旱和盐胁迫的强烈诱导,但对于甲基茉莉酸、乙烯、ABA及伤害处理不敏感。该研究结果表明,此基因可能通过ABA非依赖性信号转导途径来调节植物非生物胁迫应答。
- 邱波江伟民沈乾唐克轩
- 关键词：青蒿非生物胁迫转录因子
- 木本曼陀罗中催化东莨菪碱生物合成关键步骤的H6H基因克隆与表达分析被引量：4
- 2015年
- 莨菪碱6β-羟化酶(hyoscyamine 6 beta-hydroxylase,H6H)是托品烷类生物碱(tropane alkaloids,TAs)合成途径中的最后一个限速酶,直接催化东莨菪碱的生物合成,同时也是TAs代谢工程改造的首要靶标基因。本研究克隆了木本曼陀罗(Datura arborea)H6H基因的全长c DNA和g DNA序列(命名为Da H6H,c DNA Gen Bank登录号为KR006981,g DNA Gen Bank登录号为KR006983),对该基因进行了组织和诱导表达并在大肠杆菌中进行了重组表达。Da H6H基因c DNA全长1 375 bp,编码347个氨基酸残基,其g DNA含有4个外显子和3个内含子,和曼陀罗(Datura stramonium)的H6H基因相似性最高。Da H6H编码蛋白也与曼陀罗的H6H序列一致性最高(90.5%),具备保守的2-oxoglutarate结合基序和两个iron结合基序。q PCR检测Da H6H在老叶中表达量最高,其次为须根,主根中不表达,同时其表达受Me JA的抑制。大肠杆菌重组诱导表达成功诱导出了约39 k D的重组Da H6H蛋白。对比了不同TAs资源植物发根和根中的东莨菪碱和莨菪碱含量,表明木本曼陀罗是少有的东莨菪碱占优势的植物。Da H6H基因的克隆和重组表达为深入研究不同植物中TAs生物合成的分子调控机制奠定了基础,同时也为开展东莨菪碱代谢工程研究提供了新的候选基因。
- 强玮侯艳玲李笑夏科廖志华
- 关键词：木本曼陀罗代谢工程
- 转NtPMT和HnH6H转变莨菪碱型颠茄为东莨菪碱型颠茄
- 2016年
- 颠茄（Atropa belladonna）是生产药用托品烷类生物碱（tropane alkaloids,TAs）的商业药用植物。颠茄中莨菪碱含量远高于东莨菪碱,其化学型属于莨菪碱型,提高其东莨菪碱含量,使其化学型转变为东莨菪碱型是该产业追求的共同目标。本课题组在已经获得的T0代转NtPMT和HnH6H颠茄基础上,采用自交法培育出T1代转基因颠茄并在西藏林芝进行了田间试验。在T1代转基因颠茄中能同时特异性地扩增出461 bp的NtPMT和1 077 bp的HnH6H片段,在野生型颠茄中则不能,表明获得了阳性的T1代转基因颠茄。RT-PCR表明NtPMT和HnH6H在转基因颠茄叶片有表达。HPLC检测莨菪碱和东莨菪碱结果表明：T1代转基因颠茄叶片和茎杆几乎没有莨菪碱,东莨菪碱是主要的生物碱;野生型颠茄叶片和茎杆绝大多数为莨菪碱（东莨菪碱含量极低）。T1代转基因颠茄叶片中东莨菪碱含量比野生型颠茄叶片提高了15-36倍;T1代转基因颠茄茎杆中东莨菪碱含量比野生型颠茄茎杆提高了37-108倍。NtPMT和HnH6H双基因过表达使得莨菪碱转化为价值更高的东莨菪碱,大大提高了颠茄药用和商业价值。
- 权红夏科曾俊岚陈敏兰小中廖志华
- 关键词：代谢工程
