山东省高等学校科技计划项目(J12LK02)
- 作品数：3 被引量：5H指数：1
- 相关作者：梁淑娟岳翠青刘艳菲邵华明林志娟更多>>
- 相关机构：潍坊医学院更多>>
- 发文基金：山东省高等学校科技计划项目国家自然科学基金山东省科技攻关计划更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 三质粒慢病毒包装细胞体系的构建及其感染效率检测被引量：3
- 2013年
- 目的建立一种基于三质粒的慢病毒包装细胞体系并对其感染效率进行检测。方法利用双酶切方法构建一个pLVTHM重组慢病毒表达载体，然后与pSPAX2，pMD2．G共转染HEK293T获取慢病毒原液，利用高速离心的方法对其进行浓缩纯化。设定不同感染复数（1，5，10，15，20），将上述制备的慢病毒制品感染HEK293T和HepG2肝癌细胞，荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达水平以确认制备的病毒是否成功，其感染效率如何。结果利用一段非沉默性基因片段，构建了一个pLVTHM重组慢病毒表达栽体，将其与两个包装质粒共转染HEK293T细胞后，荧光显微镜下可见发出明亮绿色荧光，证明上述栽体成功转染到包装细胞中。于转染后42h和66h分剐收集细胞培养上清，获得含有慢病毒的原液，对病毒进行浓缩后获得浓度为l×10^8Tu／ml的病毒浓缩液。利用浓缩的病毒感染HEK293T和HepG2细胞，随着感染时间及感染复数值的增加，细胞内绿色荧光表达明显增强，感染后24h时HEK293T细胞内即可见明亮绿色荧光，其感染效率约为60％；在较难进行基因转染的HepG2细胞中，感染后24h后约40％的细胞可见明亮绿色荧光。结论成功建立了三质粒慢病毒包装细胞体系，该体系可成功表达含有目的基因的慢病毒，为后续系列研究提供了重要的工作平台。
- 岳翠青邵华明林志娟刘艳菲吴国庆梁淑娟
- 关键词：慢病毒载体
- 带有人红细胞生成素信号肽序列的IL-1β基因在HepG2细胞中的表达被引量：1
- 2014年
- 目的构建由经典分泌途径和非经典途径表达人IL-1β的慢病毒载体,制备慢病毒后,感染HepG2肝癌细胞,比较肝癌细胞中IL-1β表达的水平。方法分别以表达人IL-1β前体蛋白基因和人红细胞生成素(EPO)信号肽序列与IL-1β成熟蛋白融合基因的pIRES2-EGFP-proIL-1β和pIRES2-EGFP-epoIL-1β质粒为模板,PCR扩增获得人IL-1β全长基因和含有EPO信号肽与IL-1β成熟蛋白融合基因的序列,将其分别克隆入pLenti6/V5慢病毒载体中,构建由非经典途径和经典途径分泌IL-1β的pLenti6/V5-proIL-1β和pLenti6/V5-epoIL-1β慢病毒表达载体。利用三质粒包装体系在HEK293T细胞中包装生产慢病毒,随后感染HepG2肝癌细胞,双抗体夹心ELISA和Western blot法检测细胞质和培养上清中IL-1β的表达水平。结果构建了含有人IL-1β全长基因和含有EPO信号肽与IL-1β成熟蛋白融合基因的pLenti6/V5-proIL-1β和pLenti6/V5-epoIL-1β慢病毒载体,经双酶切和DNA测序证实与基因库中登录的人IL-1β以及EPO信号肽序列一致。利用三质粒系统包装制备经不同途径表达IL-1β的慢病毒,研究证实经由2条不同途径分泌表达人IL-1β的慢病毒感染HepG2细胞后,与转染空载体的对照细胞相比,细胞培养液上清和胞质中IL-1β的水平均显著升高(P<0.01),其中HepG2/epoIL-1β细胞培养液上清中成熟蛋白IL-1β的水平明显高于HepG2/proIL-1β细胞,而胞质中总IL-1β的水平HepG2/proIL-1β高于HepG2/epoIL-1β。结论构建的带有EPO信号肽序列的IL-1β基因的慢病毒载体,在HepG2细胞表达后,分泌成熟IL-1β的水平明显高于非经典途径分泌的表达载体。
- 李娜邸大琳肖伟玲付晓燕梁淑娟
- 关键词：慢病毒HEPG2细胞
- 敲低肝癌细胞STAT3抑制IFN1诱导的HepG2肝癌细胞增殖和迁移被引量：1
- 2018年
- 目的筛选并制备信号转导子与转录激活子3短发夹RNA(STAT3 shRNA)慢病毒,感染Hep G2肝癌细胞抑制其STAT3表达,观察对1型干扰素(IFN1)诱导的肝癌细胞增殖和迁移的影响及机制。方法设计并合成4段人STAT3基因的干扰序列(STAT3 shRNA 1~STAT3 shRNA 4)以及对照序列(Ctrl shRNA),与p LKO.1-sp6-pgk-GFP连接构建慢病毒表达载体,随后与骨架质粒ps PAX2、p MD2.G共转染HEK293T细胞制备慢病毒并感染Hep G2细胞。Western blot法检测STAT3的蛋白水平,筛选有效序列。敲低STAT3水平后,CCK-8法检测Hep G2细胞的增殖,TranswellTM迁移和划痕实验检测Hep G2细胞的迁移。同时观察2000 U/m L重组人IFNα2b诱导的肝癌细胞增殖、迁移能力的变化,Western blot法检测IFN相关STAT1信号的磷酸化水平。结果筛选对STAT3敲低效果最显著的STAT3 shRNA1和STAT3 shRNA2,敲低STAT3水平后,肝癌细胞增殖和迁移降低。2000 U/m L IFNα2b对细胞的增殖抑制作用更显著,迁移细胞的数量显著下降。敲低STAT3水平后,肝癌细胞STAT1的磷酸化水平升高,在IFNα2b处理后STAT1磷酸化水平进一步升高。结论敲低肝癌细胞STAT3通过上调STAT1信号通路活化,抑制细胞的迁移、增殖,恢复IFN在肝癌细胞中的应答。
- 李潇芳王玉琦闫奔房佩佩马超徐宁付晓燕梁淑娟
- 关键词：STAT1SHRNA肝癌
