国家自然科学基金(81172516)
- 作品数：2 被引量：2H指数：1
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- 相关机构：浙江大学医学院附属第二医院浙江大学更多>>
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- 一种真核细胞分泌型重组融合蛋白rPC的构建、表达与纯化
- 2020年
- 抑制性免疫检查点PD-1或CTLA-4靶向治疗药物已用于肿瘤的临床治疗,但单一靶点药物会有耐药发生,联合使用同时封闭多个靶点可提高疗效,因此拟构建一个可封闭多个靶点的新型重组蛋白。首先设计并合成了一个由人类PD-1和CTLA-4两个受体的胞外功能域组成并且C端带6´His标签的分泌型重组融合蛋白rPC编码序列,插入真核细胞表达载体pLVX-IRES-ZsGreen1,稳定转染HEK293细胞,收集细胞培养上清,以亲和方法纯化重组蛋白rPC,通过实时荧光定量PCR检测多个人类肿瘤细胞系中PD-1配体PD-L1、PD-L2和CTLA-4配体CD80、CD86的表达,以选择相对高表达的细胞,利用细胞免疫荧光染色方法检验rPC与肿瘤细胞的结合能力,并用CCK-8法检测rPC是否对肿瘤细胞的生长有影响。结果表明,重组融合蛋白rPC可由稳定转染表达载体的HEK293细胞表达并分泌,纯化后的rPC可以与PD-1和CTLA-4配体表达相对较高的肺癌细胞NCI-H226结合,并且rPC处理对其生长并无直接影响,与预期一致。成功获得的重组融合蛋白rPC可用于进一步的体内外功能研究,也为今后研发新型多靶点肿瘤免疫治疗蛋白药物打下了坚实的基础。
- 李春春谢雨琼曹江邵吉民
- 关键词：重组融合蛋白PD-1CTLA-4
- eIF3g差异表达的乳癌细胞模型的建立被引量：2
- 2012年
- 真核翻译起始因子3的亚单位eIF3g在一些多药耐药肿瘤细胞中表达上调。背景相近而eIF3g表达有明显差异的肿瘤细胞模型的建立对阐明其作用及机制有重要意义。该研究利用四环素调控的Tet-On Advanced诱导表达系统,分别构建了可诱导过表达外源性eIF3g和表达eIF3g人工microRNA的载体,并包装为相应的慢病毒,将慢病毒分别感染乳腺癌细胞Bcap37,经400μg/mLG418和0.4μg/mL Puromycin筛选后,分别获得稳定转染的乳癌细胞克隆Bcap37/Tet-On-eIF3g和Bcap37/Tet-On-eIF3gmiR。将这些细胞克隆分别在1μg/mL DOX的作用下诱导培养72 h,用West-ern blot检测eIF3g的表达。结果显示,Bcap37/Tet-On-eIF3g中eIF3g表达明显增加,Bcap37/Tet-On-eIF3gmiR中eIF3g表达抑制明显。该工作成功建立了可诱导外源性eIF3g过表达和抑制内源性eIF3g表达的乳腺癌细胞模型,为进一步的研究打下了基础。
- 李春春陈丽红叶景佳张行曹江
- 关键词：乳腺癌细胞模型
