广东省医学科学技术研究基金(B2006089)
- 作品数：4 被引量：38H指数：3
- 相关作者：查振刚王双利刘宁吴昊杨淑野更多>>
- 相关机构：暨南大学附属第一医院暨南大学更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划广东省医学科学技术研究基金广东省科技攻关计划更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 改进酶消化法培养SD大鼠成骨细胞及其鉴定被引量：22
- 2008年
- 目的:改进SD大鼠成骨细胞的体外分离、培养方法并进行功能鉴定。方法:将新生SD大鼠处死,无菌条件下取出颅骨,剔净骨膜后剪成1mm×1mm×1mm大小组织块。组织块经0.25%胰蛋白酶消化20min,继以0.1%Ⅱ型胶原酶消化60min,收集上清离心,所得成骨细胞接种于培养瓶中并行"多次贴壁法"纯化。观察细胞形态学,选用碱性磷酸酶Gomori钙钴法染色,钙结节茜素红法染色及Ⅰ型胶原免疫组化染色等方法进行鉴定。结果:培养的细胞具有典型的成骨细胞形态特征,在体外培养时可维持其在体内的功能,即合成碱性磷酸酶、形成矿化结节,Ⅰ型胶原染色阳性。结论:用改进后的酶消化法分离、培养SD大鼠成骨细胞,更能减少胰蛋白酶在消化过程中对细胞造成的损伤,所获成骨细胞量多、纯度高,操作简易可行,可作为骨组织工程种子细胞常规的培养方法。
- 王双利查振刚刘宁杨淑野吴昊姚平张嘉晴
- 关键词：成骨细胞
- 优化酶消化法体外培养及鉴定SD大鼠的成骨细胞(英文)被引量：3
- 2008年
- 背景:体外成骨细胞的培养技术已经有了很大的发展。但是,在培养过程中,如果胰蛋白酶的消化时间过长,成骨细胞膜便易受到损伤;同时,传统的培养方法存在所获得的成骨细胞数量少、纯度不高等不足。因此,有必要探求一种新的体外培养成骨细胞的方法。目的:优化成骨细胞在体外条件下的培养方法并对其进行鉴定。设计:观察性实验。单位:暨南大学附属第一医院骨科。材料:实验于2007-03/05在暨南大学附属第一医院骨科完成。选用出生24h的SD大鼠8只,由南方医科大学实验动物中心提供,雌雄不拘。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。实验用Ⅱ型胶原酶由美国Sigma公司分装,胰蛋白酶为Sigma公司产品,碱性磷酸酶试剂盒由南京建成生物制品公司生产,SABC-1021试剂盒由武汉博士德公司进口分装。方法:挑选24h之内的新生SD乳鼠麻醉后处死,无菌条件下取出颅骨,剔除附着的结缔组织及骨膜,D-Hank’s液冲洗3次。不强调对颅骨内、外膜,骨缝连接处等附着的结缔组织及颅顶的透明软骨结节等进行反复多次的剔除,避免操作时间过长影响细胞的存活率。结合0.1%Ⅱ型胶原酶来消化SD乳鼠颅骨,减少并严格控制胰蛋白酶的消化时间。组织块经0.25%胰蛋白酶消化20min,继以0.1%Ⅱ型胶原酶消化60min,收集上清离心,所得成骨细胞接种于培养瓶中并行"多次贴壁法"纯化。主要观察指标:应用倒置相差显微镜、透射电子显微镜、扫描电子显微镜观察成骨细胞形态特点。采用碱性磷酸酶Gomori钙钴法染色、钙结节茜素红法染色及Ⅰ型胶原免疫组织化学染色方法进行鉴定成骨细胞生物学特性。结果:原代和传代培养的细胞具有活跃的增殖能力,细胞呈多角形或梭形,具有多个突起可互相连接,细胞核较幼稚,细胞器丰富,具有典型的成骨细胞形态特征。体外培养的成骨细胞可分泌碱�
- 王双利刘宁杨淑野吴昊查振刚
- 关键词：成骨细胞SD大鼠
- 成骨细胞诱导骨髓基质细胞体外成骨的初步研究被引量：5
- 2009年
- 目的:探讨在不使用细胞因子或化学药物的情况下,成骨细胞(Osteoblast,OB)与骨髓基质细胞(Bone Marrow Stromal Cells,BMSCs)混合培养时,成骨细胞提供的成骨微环境能否在体外诱导BMSCs向成骨细胞分化,并复合支架形成成熟的骨组织。研究成骨细胞诱导BMSCs有效成骨的最小比值(指成骨细胞与骨髓基质干细胞数量的比值)。方法:分别培养SD乳鼠的成骨细胞与SD大鼠的BMSCs,将成骨细胞和BMSCs以1∶9、2∶8、3∶7、1∶0的不同比例进行混合培养,通过测定第3、6、9天培养液上清中的碱性磷酸酶(ALP)的含量,研究成骨细胞促BMSCs有效成骨的最小比值。将两种细胞以该最小浓度比混匀接种于涂附I型胶原壳聚糖材料支架上(直径9 mm,高3mm)作为混合培养组,相同终浓度的单纯成骨细胞和单纯BMSCs分别接种于相同支架作为阳性对照及阴性对照。另设置低比值成骨细胞对照组(仅含有共培养组中相同的成骨细胞数,但不含有共培养组中的BMSCs)。全部标本均于体外培养8周后取材,通过大体观察、组织学及免疫组织化学等相关检测对新生骨进行评价。结果:成骨细胞和BMSCs以3∶7的比例进行混合培养时已可实现有效成骨。3∶7比例的混合培养组及阳性对照组(成骨细胞组)体外培养8周后大体观察和苏木素-伊红染色(HE)、ALP染色基本相同,均表达骨特异性细胞外基质I型胶原,形成了较成熟的骨组织。阴性对照组(单纯BMSCs组)和低比值成骨细胞组,原细胞支架复合物变小、变形。低比值成骨细胞组在局部形成了少量的骨组织,阴性对照组(单纯BMSCs组)未能发现骨样组织形成。结论:在不使用细胞因子或化学药物的情况下,成骨细胞提供的成骨微环境能够在体外诱导BMSCs向成骨细胞分化并形成成熟的骨组织。混合细胞中成骨细胞与BMSCs的比例为3∶7时是有效成骨的最小比值。
- 刘宁查振刚王双利林宏生王国普
- 关键词：骨髓基质细胞成骨细胞骨形成
- PLGA-Ⅱ型胶原复合rhBMP-2/bFGF修复兔膝关节软骨的缺损被引量：8
- 2009年
- 目的:探讨经Ⅱ型胶原涂层改性后的聚丙交酯-乙交酯(PLGA)材料(PLGA-Ⅱ型胶原)用作生长因子重组人骨形态发生蛋白2(rhBMP-2)和碱性成纤维生长因子(bFGF)载体来修复兔膝关节软骨缺损的可行性和有效性。初步探讨生长因子rhBMP-2和bFGF之间在修复兔膝关节软骨缺损中的协同作用机制。方法:将45只成年新西兰兔随机分成A^E 5组,每组9只,用在兔右侧膝关节内侧髁钻孔的方式建立软骨缺损模型,A组植入PLGA-Ⅱ型胶原/rhBMP-2+bFGF复合物,B组植入PLGA-Ⅱ型胶原/rhBMP-2复合物,C组植入PLGA-Ⅱ型胶原/bFGF复合物,D组植入单纯PLGA-Ⅱ型胶原支架材料,E组未植入任何材料。将A、B、C组统称为实验组,D、E组统称为对照组。分别于术后4周,8周,12周处死动物,取材进行大体、组织学观察。结果:实验组的复合材料对软骨缺损的修复都有不同程度的促进作用,其中A组的效果最佳,对照组的软骨缺损的修复不明显,实验组总评分与对照组相比差异有显著性意义(P<0.05)。结论:3种带生长因子的复合体材料对兔软骨缺损的修复都有明显的促进作用。PLGA-Ⅱ型胶原复合物可用作生长因子rhBMP-2和bFGF的载体材料。生长因子rhBMP-2、bFGF对软骨缺损的修复均有促进作用,并且在剂量比为0.5 mg∶50 ng时存在着协同作用。
- 束志勇查振刚汪炬黄春华刘宁吴昊王双利
- 关键词：聚丙交酯-乙交酯重组人骨形态发生蛋白关节软骨缺损
