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五指山小型猪外周血白细胞cDNA文库的构建与鉴定被引量：5: 2009年; 目的运用SMART技术,构建了五指山小型猪外周血白细胞cDNA文库。方法用RNAiso reagent(TaKaRa)处理新鲜血液,以总RNA抽提试剂盒(上海华舜)制备总RNA。用Powerscript TM反转录酶逆转录合成第一链cDNA,LD-PCR扩增获得cDNA双链,Sfi I酶切和CHROMASPIN-400TM柱分离后,500 bp以上的片段与pDNR-LIB载体连接,电转化入E.coli.DH5α,建成原始文库。然后,扩增文库并随机挑取单菌落,PCR鉴定重组子插入片段大小。结果经鉴定,库容量达到1.5×106克隆,原始文库滴度为9.7×109cfu/mL,扩增后的文库滴度为6.4×1010cfu/mL。重组率接近100%,插入片段大小为0.5～2 kb,平均长度约为1.1 kb。结论构建的五指山小型猪外周血白细胞cDNA文库符合建库要求,可以用于全长cDNA的筛选。为五指山小型猪新基因的获得及结构和功能研究提供了可靠材料。; 申明霞刘涛杜丽王凤阳成鹰李治深满初日嘎林杰材祁超; 关键词：五指山小型猪外周血白细胞 CDNA文库

基因Ⅳ型猪戊型肝炎病毒重组ORF3蛋白抗原间接ELISA诊断方法的建立被引量：6: 2009年; 为建立检测猪戊型肝炎病毒(HEV)抗体的间接ELISA诊断方法,将HEV ORF3片段克隆至大肠杆菌表达载体pET42a(+)中,构建了原核表达载体pET42a-ORF3,将其转化大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG诱导表达,并对表达的融合蛋白进行Ni2+-NTA柱纯化及SDS-PAGE、Western-blot鉴定,用纯化的融合蛋白作为包被抗原建立了间接ELISA检测方法。结果显示,GST-ORF3在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了高效表达,表达的蛋白质分子质量约为45.5 ku,具有良好的抗原性。用建立的间接ELISA检测190份猪血清样品,阳性率为84.7%,与试剂盒检测结果相比,阳性符合率为91.5%。表明,建立的间接ELISA方法具有较好的特异性和灵敏性,可用于猪血清HEV抗体的检测。; 刘涛杜丽王凤阳雷明崔克成鹰陈品林王轶林杰材满初日嘎; 关键词：猪戊型肝炎病毒 ORF3 原核表达间接酶联免疫吸附试验

五指山小型猪APEX1基因cDNA的克隆及生物信息学分析被引量：1: 2009年; [目的]对五指山小型猪脱嘌呤嘧啶核酸内切酶cDNA进行克隆和生物信息学分析。[方法]以构建的五指山小型猪外周血白细胞cDNA文库为材料,采用菌落PCR方法,克隆得到APEX1基因全长cDNA,并运用生物信息学软件对该基因核苷酸序列及其编码蛋白的理化性质及二级结构等进行分析和预测。[结果]生物信息学分析表明,该cDNA全长1392bp,5′非翻译区长132bp,3′非翻译区长303bp,含有一个957bp的完整开放阅读框,编码318个氨基酸。该蛋白的分子量为35kD,等电点为8.05。比对分析表明,五指山小型猪APEX1基因的核酸序列及其氨基酸序列与人、小鼠、黑猩猩等哺乳动物具有较高的相似性。[结论]成功克隆了五指山小型猪A-PEX1基因cDNA,为进一步研究APEX1在动物体内的作用机制奠定了基础。; 李治深杜丽刘涛申明霞王凤阳成鹰陈品林林杰材满初日嘎祁超; 关键词：五指山小型猪 CDNA文库克隆

五指山小型猪PMSA6基因cDNA克隆及生物信息学分析被引量：3: 2009年; 为了对海南五指山小型猪蛋白酶体亚基α型6(proteasome subunit alpha type 6,PMSA6)cDNA基因进行克隆和生物信息学分析,笔者以构建的五指山小型猪外周血白细胞cDNA文库为材料,采用菌落PCR方法,克隆得到PMSA6全长cDNA,并向GenBank递交了该序列(登录号:FJ358606).同时运用生物信息学软件对该基因核苷酸序列进行了分析,并预测了其编码蛋白的理化性质及二级结构等.生物信息学分析表明:该cDNA全长1029 bp,5′非翻译区长96 bp,3′非翻译区长192 bp,含有一个741 bp完整的开放阅读框,编码246个氨基酸.该蛋白的分子量为37.680 kD,等电点为8.76.进一步比对分析发现,五指山小型猪PMSA6基因的核酸序列及其氨基酸序列与人、牛等哺乳动物具有很高的相似性.本研究成功克隆了海南五指山小型猪PM-SA6基因cDNA,并进行了相关生物信息学分析,为进一步研究PMSA6在动物体内的作用机理奠定了基础.; 刘涛申明霞杜丽程立生王凤阳成鹰李治深; 关键词：五指山小型猪 CDNA文库克隆生物信息学分析

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海南省教育厅高等学校科学研究项目(Hj200804)