国家自然科学基金(31101933)
- 作品数:11 被引量:37H指数:6
- 相关作者:葛均青陈强林天龙杨金先宋铁英更多>>
- 相关机构:福建省农业科学院福建农林大学福建省疾病预防控制中心更多>>
- 发文基金:国家自然科学基金福建省属公益类科研院所基本科研专项福建省科技计划项目更多>>
- 相关领域:农业科学更多>>
- 鳗鲡疱疹病毒ORF95基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达被引量:6
- 2012年
- 鳗鲡疱疹病毒(Anguillae herpesvirus,AngHV)是淡水鳗鲡的主要病毒性疾病病原之一。根据鳗鲡疱疹病毒(AngHV-1)的基因组序列(GenBank:NC-013668)设计引物,扩增鳗鲡疱疹病毒福建株(AngHV-FJ)ORF95基因的开放阅读框序列,克隆至pMD19-T载体;经限制性内切酶酶切和测序鉴定,进一步将其克隆至原核表达载体pET-32a,构建了表达质粒32a-ORF95,将其转化表达菌株BL21(DE3),经IPTG诱导,实现了ORF95在大肠杆菌中的高效表达。在0.1mmol.L-1 IPTG、23℃诱导14h的条件下,可溶性ORF95蛋白的表达量较高,经镍柱纯化获得了高纯度的融合蛋白。
- 李友娟葛均青宋铁英林天龙
- 关键词:基因克隆原核表达
- 鳗鲡疱疹病毒ORF8基因的克隆表达及转录时相分析被引量:1
- 2021年
- 为研究鳗鲡疱疹病毒(Anguillid herpesvirus,AngHV)ORF8基因的特性,根据GenBank中AngHV参考株(NC_013668)的ORF8序列设计引物,采取PCR方法从分离的AngHV福建病毒株(AngHV-FJ)基因组中扩增出特异性片段,克隆至pMD19-T载体,经酶切和测序验证,获得了ORF8的基因序列。结果表明:经生物信息学分析,ORF8编码的蛋白稳定性较好,存在跨膜结构且抗原表位多,符合病毒囊膜蛋白的特征;经转录时相分析,ORF8是病毒的早期基因(early gene,E),可能在病毒感染的早期阶段就发挥作用;将ORF8克隆至表达载体pET-32a,转化入大肠杆菌E.coli BL21中,以IPTG诱导蛋白表达,通过SDS-PAGE及Western blot检验,实现了ORF8在大肠杆菌中的高效表达,进一步通过割胶的方法获得了相对分子质量约为44000的高纯度融合表达蛋白。本研究为下一步评价该表达蛋白的免疫效果和制备抗体,以及开发免疫诊断试剂和疫苗提供了研究基础。
- 陈曦李英英陈强宋铁英葛均青
- 关键词:转录时相克隆原核表达
- 水生动物双RNA病毒的研究进展被引量:4
- 2014年
- 水生动物双RNA病毒(Aquabirnavirus,ABV)隶属双RNA病毒科Birnaviridae,是一类可引起水生动物爆发传染性病毒病的病原,在世界范围内给水产养殖业造成了巨大损失,其代表种为传染性胰脏坏死病毒(Infectious Pancreatic Necrosis Virus,IPNV)。ABV的基因组包括两段分节的RNA,以负链RNA为模板进行病毒基因组复制,编码5种成熟的蛋白;本文结合ABV的功能基因、致病机理、诊断检测及免疫防治等近年研究的热点做一综述,以期为研究者提供参考。
- 葛均青龚晖陈超
- 创伤弧菌外膜蛋白免疫刺激复合物最小免疫剂量测定被引量:2
- 2012年
- 为探讨创伤弧菌Vibrio vulnifiticus外膜蛋白(outer membrane protein,OMP)免疫刺激复合物(Immune stimulating Complexs,ISCOMs)的抗原性,制备创伤弧菌OMP-ISCOMs腹腔注射免疫欧洲鳗鲡Anguilla anguilla(平均规格为17g·尾-1),通过免疫血清学检测和攻毒保护试验,测定ISCOMs最小免疫剂量。结果表明,于免疫后第30d用FJ03-X2菌株攻毒,免疫组40、20、10、5μg·尾-1的免疫保护力分别为100%、87.5%、75%、50%;免疫血清效价分别为1∶6 400、1∶3 200、1∶800、1∶200。结果说明创伤弧菌外膜蛋白ISCOMs的最小免疫剂量为0.59μg.g-1水温(24±1)℃,并证实了创伤弧菌OMP-ISCOMs具强抗原性。
- 许斌福龚晖陈秀锦田丁陈强陈永聪林天龙
- 关键词:创伤弧菌最小免疫剂量欧洲鳗鲡
- 鳗鲡疱疹病毒的分离与鉴定被引量:14
- 2014年
- 为获知鳗鲡"脱粘败血病"与病毒的关系,实验用蔗糖密度梯度离心的方法从发病的欧洲鳗鲡内脏器官组织匀浆液中纯化了病毒粒子,负染后利用电镜观察;进一步用EO细胞对病毒进行了分离、培养,并对感染病毒的细胞进行超薄切片,电镜观察;然后,提取病毒DNA,利用鳗鲡疱疹病毒的PCR检测方法对其进行了鉴定。结果显示,接种匀浆上清液的EO细胞出现细胞融合的病变效应;分离病毒的病毒粒子具囊膜,大小约为200 nm;从感染病毒的细胞上清液DNA中扩增出特异性条带,序列测定与比对分析表明,该序列与鳗鲡疱疹病毒欧洲株(AngHV-1)的序列完全一致。研究表明,利用EO细胞分离了一株鳗鲡病毒,经形态观察和DNA分析,确认该病毒为鳗鲡疱疹病毒,命名为AngHV-FJ。该研究为深入开展鳗鲡疱疹病毒的致病机制及鳗鲡"脱粘败血病"的防控研究奠定了重要基础。
- 葛均青杨金先龚晖林天龙
- 关键词:欧洲鳗鲡
- 鳗鲡疱疹病毒FJ株ORF51基因的克隆及生物信息学分析被引量:4
- 2014年
- 为了解本课题组分离的鳗鲡疱疹病毒福建株(AngHV-FJ)ORF51的结构特征,扩繁了AngHV-FJ,提取其基因组DNA,经PCR扩增,获得ORF51基因,将其克隆至pMD19-T载体中,进行DNA测序,用生物信息学方法分析AngHV-FJ ORF51基因及其编码蛋白的结构和功能。结果显示,扩增到长约720bp的ORF51基因序列,其与GeneBank上鳗鲡疱疹病毒欧洲株(AngHV-1)ORF51基因的序列完全一致。该基因编码239个氨基酸;预测ORF51基因编码蛋白的分子量为26 107.1Da,等电点为7.66,是疏水性蛋白且偏碱性;有4个跨膜域;抗原表位预测显示抗原性较好;结构预测显示,存在1个N-糖基化位点、1个O-糖基化位点、10个磷酸化位点;亚细胞定位预测显示其主要存在于内质网。本研究为解析ORF51的功能及开展AngHV的基因工程疫苗研究奠定了基础。
- 李友娟葛均青林天龙
- 关键词:克隆测序生物信息学分析
- 鳗鲡疱疹病毒ORF51基因的原核表达及多克隆抗体的制备被引量:5
- 2014年
- 将鳗鲡疱疹病毒(AngHV)福建株(AngHV-FJ)ORF51基因克隆至原核表达载体pGEX-4T-2中,构建表达质粒pGEX-4T-2-ORF51,将其转化至表达菌株E.coli BL21(DE3)中,IPTG诱导后,收集表达菌体,进行SDS-PAGE分析和免疫印迹试验验证,结果表明,获得了高效表达的AngHV-FJ ORF51融合蛋白.经割胶回收纯化,获得高纯度的融合表达蛋白.用纯化的表达蛋白免疫新西兰大白兔,获得了高效价的兔抗ORF51多克隆抗体.这为进一步研究ORF51蛋白的结构和功能及开展AngHV病的防治研究提供了重要的研究基础.
- 李友娟郭凤达葛均青林天龙
- 关键词:原核表达蛋白纯化多克隆抗体
- 鳗鲡病毒性疾病病料中鳗鲡疱疹病毒的PCR检测被引量:19
- 2012年
- 结合流行病学、临床症状、病理变化等对2006~2012年收集的发病濒死鳗鲡病料进行分类,确定疑似鳗鲡病毒性疾病病料36份,提取病料主要内脏器官(肝、脾、肾)DNA,进行鳗鲡疱疹病毒的PCR检测。从"脱粘败血病"、"红头病"、"烂鳃病"的鳗鲡病料中检测到6份阳性结果,表明这些疾病可能是由鳗鲡疱疹病毒引起的。DNA测序结果显示,扩增的病毒DNA聚合酶基因片段与分离自台湾、日本及欧洲的病毒株完全一致,表明这些病毒可能为同一病毒株。
- 葛均青杨金先李友娟陈强林天龙
- 关键词:鳗鲡