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国家科技重大专项(2008ZX10001-012)

作品数：10 被引量：28H指数：3
相关作者：阮力万延民张聪优徐建青高瑛瑛更多>>
相关机构：中国疾病预防控制中心复旦大学中国医学科学院北京协和医学院更多>>
发文基金：国家科技重大专项国家自然科学基金国家高技术研究发展计划更多>>
相关领域：医药卫生生物学更多>>

文献类型

  • 10篇中文期刊文章

领域

  • 8篇医药卫生
  • 5篇生物学

主题

  • 6篇疫苗
  • 4篇HIV-1
  • 4篇病毒
  • 3篇细胞
  • 3篇基因
  • 2篇痘苗
  • 2篇痘苗病毒
  • 2篇痘苗病毒载体
  • 2篇缺陷病
  • 2篇密码子
  • 2篇密码子优化
  • 2篇免疫
  • 2篇免疫缺陷
  • 2篇免疫缺陷病
  • 2篇免疫缺陷病毒
  • 2篇基因修饰
  • 2篇分泌
  • 2篇DNA疫苗
  • 1篇蛋白
  • 1篇蛋白疫苗

机构

  • 5篇中国疾病预防...
  • 4篇复旦大学
  • 2篇哈尔滨医科大...
  • 2篇中国医学科学...
  • 1篇宁夏医科大学...
  • 1篇温州医学院
  • 1篇医学部

作者

  • 4篇阮力
  • 3篇高瑛瑛
  • 3篇徐建青
  • 3篇张聪优
  • 3篇万延民
  • 2篇董小岩
  • 2篇黄保英
  • 2篇齐香荣
  • 2篇王甲业
  • 2篇许雪梅
  • 2篇邓瑶
  • 2篇吴小兵
  • 2篇谭文杰
  • 2篇李妍
  • 2篇孟昕
  • 2篇黄杨
  • 2篇仇超
  • 2篇凌虹
  • 2篇王文玲
  • 1篇刘丹

传媒

  • 3篇生物技术通讯
  • 2篇中华微生物学...
  • 1篇中国地方病学...
  • 1篇生物工程学报
  • 1篇国际免疫学杂...
  • 1篇中华疾病控制...
  • 1篇中国科学：生...

年份

  • 3篇2012
  • 2篇2011
  • 5篇2010
共 10 条 记 录，以下是 1-10
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排序方式：
I型人类免疫缺陷病毒包膜糖蛋白120V4区氨基酸位点突变对感染细胞能力的影响被引量：2
2012年
目的探讨I型人类免疫缺陷病毒（HIV-1）包膜糖蛋白120V4区氨基酸位点发生突变对CCR5及CXCR4嗜性毒株感染靶细胞能力的影响。方法根据ADA株为CCR5嗜性毒株，只具有感染CCR5细胞的能力；HXB2株为CXCR4嗜性毒株，只具有感染CXCR4细胞的能力，通过重叠延伸剪接的方法，构建CCR5嗜性及CXCR4嗜性毒株V4区丙氨酸替换突变体。将突变体表达载体与带有荧光报告基因的HIV骨架基因表达载体共同转染真核细胞，制备假病毒颗粒。采用酶联免疫吸附（ELISA）法检测假病毒中HIV-1P24抗原，对假病毒进行定量。将假病毒按20、40ng感染U87．CD4.CCR5和U87．CD4．CXCR4细胞，以野生株ADA和HXB2毒株为对照，通过荧光素酶（RLU）测定，检测HIV-1V4区氨基酸386—417位点各突变体假病毒对细胞的感染能力。结果成功构建HIV-1ADA和HXB2株V4区丙氨酸替换突变体，各获得10株突变体。在ADA株和HXB2株，389—391及414—417位点均发生丙氨酸替换突变体，无论是用20ng，还是40ng假病毒感染，对CCR5及CXCR4细胞的感染能力均完全丧失[（0±0）％]；在ADA株，400-403和408--410位点发生丙氨酸替换突变体，当假病毒在20ng时，感染细胞的能力达到了（124±35）％和（182±29）％；在40ng时，感染能力达到了（127±8）％和（134±16）％；在HXB2株，395—397位点发生丙氨酸替换突变体，当假病毒在20ng时，感染能力达到了（144±42）％；在40ng时，感染能力达到了（121±18）％；两株在其他位点发生丙氨酸替换突变体，但仅保留部分感染细胞能力（15％-84％）。结论HIV—1包膜糖蛋白V4区389—391及414—417位点氨基酸发生丙氨酸突变．使病毒完全丧失感染靶细胞能力。
张唯哲李妍王甲业杨丹王璐晶凌虹
关键词：I型人类免疫缺陷病毒包膜糖蛋白点突变
中国HIV-1 CRF01_AE流行株结构基因和调节／辅助基因DNA疫苗的构建和免疫原性研究被引量：5
2010年
目的构建表达gag—env融合基因和tat-rev-integrase（c-half）-vif-nef融合基因的DNA疫苗，并评价其免疫原性。方法按人源密码子使用频率对AE2f株的gag、env、tat、rev、integrase、vif和nef基因序列进行优化，构建真核表达质粒。用Westernblot法验证体外表达情况；用ELISPOT法检测小鼠的细胞免疫反应。结果限制性酶切及DNA测序结果表明两个融合基因质粒构建正确，可以表达相应的融合蛋白。ELISPOT结果显示，Gag—Env特异性的T细胞反应强度为（3010±566）SFC／10^6脾细胞；Tat-Rev—Integrase（C．half）-Vif-Nef融合蛋白特异性的T细胞反应为（948±737）SFC／10^6脾细胞，均显著高于空载体组。结论构建的表达HIV-1CRF01_AE流行株gag—env融合基因和tat—rev-integrase（c-half）-vif-nef融合基因的DNA疫苗可以正确表达所编码的融合蛋白并有效地激活机体的T细胞免疫反应。
袁松华万延民仇超张聪优黄杨乔勇叶芮琪邱趁丽张晓燕徐建青
关键词：HIV-1艾滋病疫苗结构基因调节基因
HIV-1包膜蛋白疫苗免疫原选择及改造策略研究进展被引量：5
2010年
尽管经过全球研究人员20多年的共同努力，目前仍无有效的HIV-1疫苗面世。由于HIV-1病毒可以通过多种方式逃避机体免疫应答，所以截至目前仍未找到可以有效诱导广谱中和抗体的免疫原或免疫策略，但该方面的研究从未止步。在美国和泰国开展的2个Ⅲ期临床试验显示，gp120亚单位疫苗对HIV-1感染并无保护效果，也不能在HIV-1感染后减缓疾病进展。
张聪优万延民许雪梅徐建青
关键词：HIV-1疫苗蛋白疫苗HIV-1病毒HIV-1感染包膜机体免疫应答
外源性组织型纤溶酶原激活物信号肽突变体增强蛋白质在哺乳细胞中的表达及分泌被引量：3
2010年
目的 比较不同tPA信号肽突变体对目的蛋白表达和分泌水平的影响,优化并筛选通用性外源信号肽序列.方法 通过定点突变技术将人类组织型纤溶酶原激活物（tPA）的信号肽第22位氨基酸由脯氨酸（P）突变为丙氨酸（tPA22P/A）或甘氨酸（tPA22P/G）,并将突变前后的3种信号肽序列分别插入HIV-1 p24基因的N末端,构建不同的p24蛋白表达载体,这些重组表达载体体外瞬时转染人胚肾HEK293T细胞,转染72 h后,通过SDS-PAGE与western blot检测并比较各组培养上清和细胞中p24蛋白的表达水平.结果 成功构建了3个p24蛋白的真核表达载体P24T.tPA、P24T.tPA22P/A和P24T.tPA22P/G,经序列测定证实基因序列和方向与预期相符;重组载体转染293T细胞72 h后均检测到分泌性p24的表达.与P24T.tPA组相比,P24T.tPA22P/A转染组培养上清中和细胞内p24蛋白表达水平分别提高62%和29%,P24T.tPA22P/G转染组分别提高8%和6%.结论 tPA信号肽22位由脯氨酸突变为丙氨酸或甘氨酸,这就提高了目的蛋白的表达和分泌水平,为优化外源蛋白在哺乳细胞中的表达和分泌提供了实验基础.
王甲业陈文江李妍魏国超程德春凌虹
关键词：组织型纤溶酶原激活物信号肽哺乳细胞
HIV-1 AE重组型疫苗构建及免疫原性研究被引量：1
2010年
目的利用AE亚型的膜蛋白,研发抗HI V-1 AE重组型的疫苗并进行免疫原性评价。方法构建表达中国流行株97CNGX2F(HI V-1 AE2F)包膜蛋白gp140的重组痘苗病毒rVVT140AE。使用表达gp140的DNA疫苗和rVVT140AE用初免-加强方式免疫小鼠。免疫结束后第2周处死小鼠,分别检测特异性抗体滴度和特异性T细胞反应。结果本疫苗所活化的特异性抗体滴度在3 200和51 200之间,几何平均值为11 143;总T细胞免疫反应强度为(1 918±442)SFCs/106脾细胞,其中针对env1、env2、env3、env4肽池的免疫反应强度分别为(1 280±330)SFCs/106脾细胞,(66±16)SFCs/106脾细胞,(163±34)SFCs/106脾细胞和(409±96)SFCs/106脾细胞,均显著高于空载体对照组(<10 SFCs/106脾细胞)。结论本实验构建的HI V-1 AE2F株包膜蛋白gp140重组痘苗病毒疫苗可作为针对我国HI V-1流行株的候选疫苗免疫原。
张聪优万延民仇超黄杨阮力许雪梅徐建青
关键词：HIV疫苗包膜蛋白
5个HIV基因修饰可明显提高其在不同系统中的表达被引量：2
2012年
目的:确定HIV-1疫苗中有效的交叉保护性细胞免疫抗原,提高各个基因在相应疫苗载体中的表达水平,为研究不同抗原在DNA载体和痘苗病毒载体中的免疫原性奠定实验基础。方法:选择HIV B′/C亚型5个以细胞免疫为主的抗原(Gag、Pol、Rev、Tat和Nef),进行基因序列优化及表达结构改造,并分别构建以质粒DNA和重组痘苗病毒为载体的两大类HIV-1疫苗。结果:优化前后5个目的基因均能够在这2种载体中有效表达;虽然采用相同的基因修饰策略,但与痘苗病毒载体相比,在DNA载体中各基因表达水平的提高均较为明显;含有抑制性序列(INS)的gag、pol基因经密码子优化后,Gag、Pol蛋白的表达均明显提高,其中Pol蛋白的提高更为明显,单独pol基因比gagpol天然结构表达水平要高,而gag基因却变化不大;对于rev、tat、nef基因而言,优化后的单独基因结构要略高于优化后的融合结构(hRTN),且二者均高于未优化的融合结构(RTN)。结论:为进一步确定HIV-1疫苗中有效的交叉保护性细胞免疫抗原、研究不同抗原在DNA载体和痘苗病毒载体中的免疫原性奠定了实验基础,为进一步研究DNA疫苗和重组痘苗病毒疫苗联合免疫提供了实验依据。
高瑛瑛齐香荣黄保英王文玲邓瑶孟昕谭文杰阮力
关键词：HIV-1DNA疫苗痘苗病毒载体密码子优化
HIV gag基因修饰在不同载体系统中对免疫效果的影响被引量：2
2012年
目的：了解gag基因修饰前后在不同载体系统中的表达水平差异对免疫效果的影响,为确定HIV疫苗中能诱发较高水平细胞免疫的Gag靶抗原奠定实验基础。方法：将含有优化前后gag基因的HIV-1 DNA（pVRC）疫苗和重组痘苗病毒（rVV）载体疫苗单独或联合免疫BALB/c小鼠,利用IFN-γ酶联免疫斑点法和胞内细胞因子染色检测各组的细胞免疫效果,ELISA检测体液免疫水平,分别比较基因优化前后及在不同载体内的Gag诱发的免疫效果。结果：DNA疫苗中gag基因修饰后细胞免疫反应由472提高至925 SFC/10^6MNC,抗体滴度随免疫次数增加而提高,基因修饰后第二针的抗体水平由104.2提高至105.3,三针后则没有差别;而以rVV为载体的疫苗基因修饰前后细胞免疫反应（-320 SFC/10^6MNC）和抗体水平（-10^4.4）均没有差异。2种疫苗联合免疫均可显著提高Gag修饰前后在小鼠体内的免疫效果,基因修饰后细胞免疫反应由1700提高至2100 SFC/10^6MNC,抗体水平则没有差别。结论：gag基因修饰明显提高常规DNA疫苗免疫效果,并可进一步提高联合免疫效果,但对rVV疫苗单独免疫效果无明显影响。
高瑛瑛齐香荣黄保英王文玲邓瑶孟昕谭文杰阮力
关键词：HIV-1DNA疫苗痘苗病毒载体密码子优化
人免疫缺陷病毒/艾滋病细胞免疫疫苗研究进展被引量：2
2010年
由于人免疫缺陷病毒(HIV)具有变异快、亚型多、攻击免疫系统等特殊的生物学特点,HIV/艾滋病疫苗至今尚未研制成功。20多年来,艾滋病疫苗研究主要采用中和抗体为主和细胞免疫为主等两种策略,然而目前仍没有实质性突破。诱发广谱有效的强CD8+T细胞反应是研制有效HIV疫苗的重要策略。以次要保护性抗原为靶抗原、优化目的基因表达、多抗原联合使用策略,为研究HIV细胞免疫疫苗引入了新的思路。综合分析这些进展,对于重新思考艾滋病疫苗的研究策略可能会有所帮助。
高瑛瑛阮力
关键词：人免疫缺陷病毒获得性免疫缺陷综合征细胞免疫疫苗
利用分泌型荧光素酶体外长期监测小鼠肝脏microRNA活性被引量：4
2011年
活体动物microRNA(miRNA)检测技术对阐明miRNA的生物学功能非常重要.但是,目前缺乏一种方便灵敏的实时反映活体动物miRNA活性及其变化的体外监测手段.通过在分泌型荧光素酶Gluc(Gaussia princeps luciferase)mRNA的3′非翻译区插入相应miRNA的靶序列构建一系列miRNA传感器.将miRNA传感器体外转染培养细胞和通过水动力注射方法转染小鼠肝脏,通过检测细胞培养上清和外周血液中的Gluc来反映细胞内和活体动物肝脏的miRNA活性.结果显示,CMV启动子驱动的miRNA传感器可以长期监测体外培养细胞中的miRNA和短期监测小鼠肝脏的miRNA,但由于启动子在肝脏的沉默不能用于长期监测肝脏miRNA;CAG启动子驱动的传感器则成功地实现了对肝脏内源性miR-122,miR-142和miR-34a以及对肝脏过表达的miR-34a的长期实时监测.利用以Gluc为报告基因的miRNA传感器,通过检测外周血Gluc可以方便地在体外长期连续监测小鼠肝脏的miRNA.
王刚董小岩胡键阳田文洪尉迟捷王岳吴小兵
腺病毒载体介导的重组蛋白sTNFRII-gAD快速表达和制备被引量：3
2011年
利用腺病毒载体高效感染哺乳动物细胞及表达外源基因的特性,建立一种快速高效表达及制备重组蛋白的方法,并用该方法获得sTNFRII-gAD（可溶性肿瘤坏死因子受体II-脂联素球部融合蛋白）蛋白纯品。首先用携带EGFP基因的腺病毒载体rAd5-EGFP以不同的腺病毒用量（MOI）（0-1 000）感染BHK21c022细胞,观察比较其转导效率和细胞毒性。用AdMax腺病毒载体系统制备携带融合基因sTNFRII-gAD的重组复制缺陷型5型腺病毒rAd5-sTNFRII-gAD。用rAd5-sTNFRII-gAD以不同的MOI（0~1 000）感染BHK21c022细胞,收取上清进行Western blotting分析,比较上清中sTNFRII-gAD蛋白的表达量。在此基础上,用rAd5-sTNFRII-gAD以MOI 100感染大量培养的BHK21c022细胞,在无血清培养条件下反复多次收取培养上清,经过硫酸铵浓缩、分子筛柱层析、透析等步骤浓缩和纯化sTNFRII-gAD融合蛋白,并体外测定该融合蛋白拮抗TNFα的活性。结果获得了携带sTNFRII-gAD融合基因的重组腺病毒rAd5-sTNFRII-gAD;用rAd5-EGFP感染BHK21c022细胞结果表明,随着腺病毒用量的增高,表达EGFP蛋白的BHK21c022细胞数量和亮度明显增加;MOI在0~100之间被感染的BHK21c022细胞未表现出明显的细胞毒性,MOI为1 000时可观察到细胞变圆和少量死亡现象。Western blotting分析结果表明,随着腺病毒用量的增高,培养上清中sTNFRII-gAD融合蛋白表达量明显增加,以MOI为1 000时最高。在此基础上,我们用MOI为100的rAd5-sTNFRII-gAD感染5个转瓶培养的BHK21c022细胞以制备sTNFRII-gAD融合蛋白。每个转瓶加无血清培养液100 mL,每48 h收获上清1次并换液,反复6次收取培养上清共约3 L,经过纯化获得了约11 mg的sTNFRII-gAD融合蛋白。体外活性测定实验表明,获得的sTNFRII-gAD融合蛋白能有效拮抗TNFα对L929细胞的杀伤作用。腺病毒载体/BHK21细胞表达系统是一个简便、高效、通用的表达系统,利用该系统成功制备了有生物学�
陆月刘丹张孝任刘雪荣沈炜郑刚柳云帆董小岩吴小兵高基民
关键词：腺病毒重组蛋白哺乳动物细胞
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