国家自然科学基金(30500492)
- 作品数：9 被引量：15H指数：3
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- 相关机构：江苏省人民医院南京医科大学附属儿童医院南京医科大学更多>>
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- 胰腺癌细胞系BxPC3及胰腺癌组织Ras相关区域家族1A启动子CpG岛的甲基化状态
- 2010年
- 目的 检测Ras相关区域家族1A（Ras association domain family 1A,RASSF1A）在胰腺癌细胞株BxPC3及胰腺癌组织中的甲基化状态,探讨其启动子异常甲基化在胰腺癌发病机制中的可能作用.方法 采用结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法（combined bisulfite restriction analysis,COBRA）检测胰腺癌细胞株BxPC3、5例正常胰腺组织、13对胰腺癌及相应癌旁正常胰腺组织中RASSF1A启动子CpG岛的甲基化状态,计算其甲基化率.以甲基化酶抑制剂5-Aza-dC（5-Aza-2-deoxycitydine）处理BxPC3,观察处理前后甲基化率变化情况及RASSF1A mRNA表达变化.结果 在BxPC3细胞株中,RASSF1A启动子的CpG岛甲基化率为62.90%;正常胰腺、癌旁及癌组织中平均分别为9.14%、53.79%和55.82%.与正常胰腺组织相比,胰腺癌旁及癌组织的RASSF1A启动子甲基化率明显增高（P值〈0.01）,而癌旁及癌组织之间无明显差异（P〉0.05）.BxPC3经5-Aza-dC处理后,RASSF1A的CpG岛甲基化率显著下降至42.50%（P〈0.05）,同时RASSF1A mRNA表达增强.结论 RASSF1A启动子CpG岛异常甲基化是胰腺癌发生发展中的早期事件,可能参与胰腺癌的发病过程.
- 彭泉蔡辉华高文涛钱祝银苗毅
- 关键词：甲基化CPG岛
- DNA甲基化异常对mir-615-5p在胰腺癌细胞株PANC-1中表达影响被引量：4
- 2011年
- 目的:描述胰腺癌细胞株中DNA异常高甲基化对miRNA表达抑制所起的作用。观察DNA甲基转移酶抑制剂对miR-615-5p在胰腺癌细胞株PANC-1中甲基化状态和表达的影响。方法:甲基化芯片筛选出在胰腺癌细胞株PANC-1中存在异常甲基化的miRNA。采用去甲基化药物5-氮杂胞苷(5-aza-2-adeoxycytidine,5-aza-dC)处理体外培养的PANC-1细胞,甲基化特异性聚合酶链反应(methylation-specific PCR,MSP)结合亚硫酸氢盐修饰结合测序法(bisulfite-sequencing PCR,BSP)检测用药前后miR-615-5p的甲基化状态的改变。采用RT-PCR定量检测用药前后miR-615-5p表达量的差异。结果:通过MSP和BSP发现在胰腺癌细胞株PANC-1中甲基化率明显高于正常组织。对胰腺癌细胞株用去甲基化剂5-aza-dC的作用,发现miR-615-5p甲基化率减少并伴随着表达的重新激活。结论:胰腺癌细胞株PANC-1中的miR-615-5p表达与启动子区甲基化状态有关,启动子区的高甲基化导致PANC-1中miR-615-5p的表达沉默。
- 朱墨高文涛钱祝银苗毅
- 关键词：DNA甲基化5-氮杂胞苷
- 胰腺恶性内分泌肿瘤的诊断和治疗经验被引量：1
- 2009年
- 目的总结胰腺恶性内分泌肿瘤的诊治经验。方法回顾性分析1969年1月至2008年12月南京医科大学第一附属医院收治的38例胰腺恶性内分泌肿瘤患者的临床资料。其中胰岛素瘤6例，胰多肽瘤23例，胰高血糖素瘤4例和胰腺类癌5例。结果除1例胰岛素瘤外，所有患者经术前影像学检查发现胰腺占位；手术切除率87％（33／38），病理学检查提示肝转移7例，淋巴结转移5例，血管、淋巴管发现瘤栓1例，局部浸润28例。术后随访24例，1例胰岛素瘤局部复发再次手术切除，1例胰腺类癌肝转移再次射频治疗，其余无转移、复发表现。结论影像学检查是胰腺内分泌肿瘤的主要诊断依据。其恶性程度应根据术前影像学表现、术中探查、术后病理检查并结合随访综合判定。恶性胰腺内分泌肿瘤恶性程度低，手术切除率高，预后良好。
- 高文涛钱祝银徐泽宽戴存才蒋奎荣吴峻立李强苗毅
- 关键词：胰腺肿瘤胰岛细胞
- PADRE/MUC4重组腺病毒转染树突状细胞诱导特异性CTL体外杀伤作用研究
- 2007年
- 目的:观察PADRE/MUC4重组腺病毒转染树突状细胞(DC)诱导特异性细胞毒性T细胞(CTL)及体外特异性杀伤作用。方法:pAd-CMV-PADRE/MUC4转染HLA-A2健康志愿者外周血单个核细胞(PBMC)来源的未成熟DC,TNF-α诱导成熟后与自体PBMC混合培养刺激3周,Cr51和Elispot实验检测CTL体外杀伤活性。结果:Cr51和Elispot检测结果显示PADRE/MUC4转染DC可以诱导产生特异性CTL,而pAd-CMV-GFP组和空白对照组不能产生有效特异性CTL。结论:腺病毒载体介导多表位嵌合基因(PADRE/MUC4)转染未成熟DC,在体外可以诱导产生特异性CTL,对表达MUC4肿瘤细胞具有杀伤效应。
- 吴峻立卫积书孟凯高文涛陈建敏张静静朱毅苗毅
- 关键词：腺病毒树突状细胞细胞毒性T淋巴细胞
- 胰腺癌MUC4抗原多表位嵌合基因重组腺病毒载体的构建及其在COS-7细胞的表达
- 2007年
- 目的:构建含有胰腺癌MUC4抗原多表位嵌合基因的腺病毒载体,并转染真核细胞COS-7。方法:多参数分析预测MUC4抗原HLA-A1、HLA-A2限制性CD8+T细胞表位kozac序列、引导序列以及通用Th表位PARDE和多表位基因串连后合成嵌合全基因。嵌合基因克隆到腺病毒穿梭载体pAdshuttle-CMV获得重组质粒pAdshuttle-CMV-PE。酶切鉴定后,将正确的重组质粒转化含有腺病毒骨架载体的BJ5183菌进行同源重组。PacⅠ酶切和测序鉴定正确的重组子,脂质体介导转染Ad293细胞,通过观测绿色荧光蛋白(GFP)的表达和PCR扩增目的基因的方法鉴定重组腺病毒(rAd-PE)。Ad293细胞反复感染冻融扩增病毒,流式细胞仪和TCID50检测病毒滴度。病毒颗粒感染COS-7细胞,荧光显微镜观测绿色荧光蛋白的表达以及SDS-Page分析多表位嵌合蛋白的表达。结果:成功构建了含有胰腺癌MUC4的多表位嵌合基因重组腺病毒,病毒滴度为1×1010pfu/ml。SDS-Page发现在16kD处有一符合预期大小的蛋白表达。结论:该重组腺病毒成功构建并能够在真核细胞COS-7中表达,为下一步胰腺癌的肿瘤疫苗研究奠定相应的基础。
- 高文涛卫积书吴竣立孟凯苗毅
- 关键词：腺病毒载体MUC4嵌合基因肿瘤疫苗
- 胰腺癌细胞株HOXA7基因表达及其启动子区甲基化状态
- 2010年
- 目的 检测HOXA7 mRNA在胰腺癌细胞株中的表达及其启动子区的甲基化状态,探讨两者的相关性.方法 采用RT-PCR法检测人胰腺癌细胞株BxPC3、CFPAC1、PANC1和SW1990细胞的HOXA7 mRNA的表达水平.采用重亚硫酸盐测序PCR（bisulfite sequencing PCR,BSP）和结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法（combined bisulfite restriction analysis,COBRA）检测启动子区域甲基化状态.应用去甲基化药物5-氮杂-2＇-脱氧胞苷（5-aza-2-deoxycytidine,5-aza-dC）处理各细胞株,检测处理前后细胞HOXA7 mRNA表达和甲基化状态的变化.结果 胰腺癌细胞株BxPC3、CFPAC1和SW1990细胞均表达HOXA7 mRNA,而PANC1细胞不表达HOXA7 mRNA.CFPAC1、BxPC3、PANC1和SW1990中HOXA7启动子甲基化率分别为93.16%、90.65%、90.09%、52.30%,SW1990细胞的HOXA7甲基化率较其他三株细胞均明显降低（P值均＜0.01）.经5-aza-dC处理后,PANC1细胞的HOXA7 mRNA重新表达,BxPC3的HOXA7 mRNA表达增强;而CFPAC1和SW1990细胞的HOXA7 mRNA在5-aza-dC处理前后无明显变化.结论 胰腺癌细胞株BxPC3和PANC1细胞的HOXA7mRNA表达与启动子区甲基化状态密切相关,而CFPAC 1和SW1990细胞两者无明显相关性.
- 彭泉蔡辉华高文涛钱祝银苗毅
- 关键词：胰腺肿瘤DNA甲基化5-氮杂胞苷
- 肝细胞癌中微小RNA mir219启动子区异常甲基化和表达下调被引量：3
- 2009年
- 目的:微小RNA(microRNA)异常在肿瘤发生发展中起重要作用,本研究探讨microRNA mir219在肝细胞癌中的异常甲基化和异常表达,可能参与肝细胞癌的发生发展过程。方法:采用pyrosequence、TA克隆测序等方法检测正常肝组织、肝细胞癌细胞株和肝癌标本中mir219上游预测启动子区域甲基化,Taqman实时定量RT-PCR测定肿瘤组织表达。结果:与正常肝脏组织相比,肝癌细胞株、肝癌标本中mir219上游预测启动子区域中茎环区和上游1kb区域的CpG岛存在高度甲基化。肝癌细胞株、肝癌标本中mir219表达显著下调,与其异常甲基化相关。结论:肝癌中微小RNA mir219茎环序列上游1094bp区域存在启动子区异常甲基化,表达下调,提示mir219异常可能在肝细胞癌发生发展中起重要作用,是潜在的抑癌基因。
- 韩蓓钱祝银高文涛
- 关键词：微小RNA肝细胞癌甲基化
- SOX7基因在胰腺癌细胞株的表达及其启动子区甲基化状态的研究被引量：7
- 2010年
- 目的:检测SOX7基因在胰腺癌细胞株中的表达及其启动子区的甲基化状态,初步探讨两者之间的关系。方法:采用RT-PCR检测SOX7基因在胰腺癌细胞株BXPC-3、CFPAC-1、PANC-1和SW1990中的表达水平。重亚硫酸盐测序PCR(bisulfite sequencing PCR,BSP)和结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法(combined bisulfite restriction analysis,COBRA)检测启动子区域甲基化状态。采用去甲基化药物5-氮杂胞苷(5-aza-2-adeoxycytidine,5-aza-dC)处理各细胞株后,检测SOX7基因的mRNA表达和甲基化状态变化。结果:在胰腺癌细胞株BXPC-3、CFPAC-1中SOX7基因的mRNA呈阳性表达,而在PANC-1和SW1990中SOX7基因表达沉默;与BXPC-3、CFPAC-1相比,PANC-1和SW1990中SOX7基因启动子区甲基化率较高。经过去甲基化处理后,PANC-1与SW1990中SOX7启动子区的甲基化率下降,基因重新表达。结论:胰腺癌细胞株PANC-1和SW1990中的SOX7基因表达与启动子区甲基化状态有关,启动子区的高甲基化导致PANC-1、SW1990中SOX7基因的表达沉默。
- 彭泉蔡辉华高文涛钱祝银苗毅
- 关键词：DNA甲基化胰腺癌5-氮杂胞苷
- 胰腺癌黏蛋白4基因修饰的树突状细胞疫苗构建及对胰腺癌细胞的免疫效应被引量：1
- 2009年
- 目的构建含有胰腺癌相关抗原黏蛋白（MUC）4（sv12）的腺病毒载体并转染树突状细胞（DC）构建DC疫苗，观察DC疫苗对胰腺癌细胞的免疫效应。方法NCBI获得MUC4（sv12）mRNA序列，利用片段内酶切位点和重叠聚合酶链反应（PCR）技术获得MUCA（sv12）的编码序列，编码序列克隆到腺病毒载体，构建重组腺病毒（rAd—MUC4）。病毒颗粒感染树突状细胞，产生活化的MUCA特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL），乳酸脱氢酶（LDH）释放法和Elispot法分别检测体外杀伤活性及干扰素（IFN）-γ的表达，同时设置空病毒（GFP）组和磷酸盐缓冲液（PBS）组作为阴性对照。结果成功构建含有胰腺癌相关抗原MUC4（sv12）基因的重组腺病毒，LDH法检测结果：MUCA特异性CTL对HLA-A2＋和MUC4＋Capan-1细胞的毒性[E／T=10：1时为（13．7±6．0）％，20：1时为（21．4±4．7）％，40：时为（36．1±9．5）％]，高于HLA—A2＋Mcf-7细胞及MUCA＋Bxpc-3细胞（P〈0．05）。Elispot法检测结果：E／T=20：时，Capan．1细胞的MUCA组斑点数为（139．1±23．3），高于GFP组（66．0±16．4）和PBS组（30．5±4．4），P〈0．05；GFP组和PBS组差异无统计学意义。结论腺病毒介导MUC4基因修饰的DC疫苗，可以体外诱导产生特异性CTL细胞，并获得有效的HLA限制性杀伤效应。
- 任华建张烨卫积书高文涛徐泽宽苗毅
- 关键词：胰腺癌树突状细胞
