国家公益性行业科研专项(201203082)
- 作品数：2 被引量：1H指数：1
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- 毕赤酵母分泌表达JEV prME蛋白及其形成病毒样颗粒的免疫原性鉴定
- 2017年
- 应用毕赤酵母分泌表达日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)prME蛋白,鉴定其表达效果与免疫原性,以期为JEV亚单位疫苗的研制奠定基础。RT-PCR扩增JEV SA14-14-2株prME基因,将其连接到毕赤酵母表达载体pPICZa-A,分别获得pPICZa-prME和携带JEV Cap蛋白C末端19个Aa信号肽的pPICZa-SprME质粒。表达载体用PmeⅠ酶切线性化,通过电转化转入毕赤酵母X33并诱导发酵培养。利用SDS-PAGE和Western blotting鉴定酵母发酵上清中目的蛋白的表达情况。利用GE蛋白层析纯化柱纯化目的蛋白,利用电镜观察纯化前后的目的蛋白,将不同剂量纯化后的prME蛋白与弗氏佐剂混合以及定量纯化后的prME蛋白与不同剂量的核酸佐剂混合分别免疫4周龄小鼠,定期采血,ELISA检测被免小鼠血清的抗体水平,空斑减少试验测定抗体中和效价。SDS-PAGE结果表明毕赤酵母可以分泌表达完整的prME蛋白,目的蛋白在70–100 kDa之间;Western blotting结果显示分泌表达的prME蛋白具有良好的反应原性,进一步证明prME蛋白在酵母X33中以整体的形式分泌表达,没有发生水解切割。纯化目的蛋白,根据洗脱时间和体积表明其分子量大于1×10~6 Da,因此推断prME蛋白可能形成多聚化的颗粒。电镜观察发现直径30–50 nm的病毒样颗粒(Virus like particles,VLPs)。免疫试验结果表明,纯化后的重组蛋白10–15μg/只接种小鼠在3周后抗体达到高峰值,之后逐渐下降,免疫7周后小鼠血清仍可检测到JEV抗体。将prME VLPs以10μg/只的剂量与不同剂量的核酸佐剂配伍后接种小鼠,ELISA检测结果表明核酸佐剂可明显增强JEV prME VLPs免疫应答,免疫4周后小鼠血清的中和抗体效价为1∶80–1∶160。上述结果表明毕赤酵母表达JEV prME虽不能发生水解切割,但仍可形成VLP并诱导免疫小鼠产生较高水平中和抗体。
- 赵鹏江雅王经满范浩杰曹瑞兵
- 关键词：日本脑炎病毒毕赤酵母病毒样颗粒免疫原性
- 猪OAS2抗日本脑炎病毒的活性研究被引量：1
- 2014年
- 在亚洲和一些其他地区,日本脑炎是危害重大的人畜共患病。2'-5'寡腺苷酸合成酶(2'-5'oligoadenylate synthetase,OAS)为一种干扰素诱导的抗病毒蛋白。本试验利用PCR方法获得OAS2基因ORF并将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),获得pcDNA-pOAS2;转染PK-15细胞进行pOAS2瞬时表达,通过Real-Time PCR、间接免疫荧光试验(IFA)、噬斑形成试验检测其对日本脑炎病毒(JEV)复制的影响。结果表明,猪OAS2在PK-15细胞中的瞬时表达对JEV在细胞内的复制起一定抑制作用。本试验为下一步研究OAS2抗病毒作用奠定基础。
- 朱丹连雪顾金燕曹瑞兵陈溥言
- 关键词：日本脑炎病毒抗病毒活性
