河南省科技攻关计划(0424410035)
- 作品数：16 被引量：48H指数：4
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- 幽门螺杆菌黏附素HpaA蛋白在大肠杆菌中表达及其免疫保护作用被引量：1
- 2010年
- 目的表达和纯化幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)黏附素HpaA蛋白,研究其免疫活性和对小鼠的免疫保护作用。方法诱导TB1(pMAL-c2X-hpaA)表达H.pylori黏附素HpaA蛋白,Amyloss树脂预装柱进行分离、纯化,Western blot鉴定其免疫学活性;纯化蛋白免疫小鼠后,H.pylori国际标准菌株NCTC11637攻击感染,观察H.pylori定植情况及免疫保护效果。结果获得了高纯度且免疫活性良好的目的蛋白;HpaA蛋白免疫小鼠的保护率为53.33%(8/15),与对照组统计学差异显著(P=0.002)。结论纯化HpaA蛋白对小鼠有免疫保护作用,可作为H.pylori基因工程疫苗的候选组分。
- 黄学勇许汴利段广才范清堂郗园林
- 关键词：幽门螺杆菌小鼠模型免疫保护
- 志贺菌耐多药外排泵emrE基因作用分析被引量：4
- 2009年
- 目的对临床耐多药志贺菌株H24的1种小多重耐药性家族(SMR)外排泵emrE基因进行定向分子进化,研究基因突变增强emrE外排泵耐药性的潜力,调查志贺菌外排泵基因emrE基因垂直进化对临床耐药发展的影响。方法通过用体外易错PCR(EP-PCR)方法对emrE基因进行随机突变实验,用微量稀释生长曲线法进行菌株的耐药性筛选,用荧光实时定量RT-PCR测定基因表达情况,应用DNA分析软件DNAStar进行生物信息学分析。结果在31个突变子中筛选到了突变子ep2-emrE(DH5α),它的emrE基因有6个氨基酸突变,分别为Thr-28→Ala,Cys-39→Ser,Tyr-40→终止子,Ser-72→Arg,Leu-93→Phe,Ile-101→Phe。它不但增强四环素和红霉素的耐药能力,还产生新的氯霉素耐药能力。结论尽管emrE基因较易获得新增耐药性,但在志贺菌对四环素、红霉素等抗生素耐药性发展中,emrE基因的进化突变没有被筛选,表明有其他能力更强的耐药基因在突变进化中起作用。
- 吴健穆瑞瑞任存邦王春阳李珏张卫东范清堂段广才
- 关键词：志贺菌耐药性分子进化
- 志贺菌多耐药现状与多耐药机制被引量：1
- 2011年
- 志贺菌属细菌是引起细菌性痢疾(菌痢)的主要病原菌。近年来,随着抗菌药物大量用于治疗菌痢,临床上出现大量多重耐药志贺菌株,这些多耐药株产生速度快,耐药率高,从而使菌痢的发病率居高不下。为了控制菌痢的蔓延及流行,研究志贺菌属的多重耐药机制迫在眉睫。为了详细了解志贺菌属细菌的多重耐药机制及探索解决其问题的途径,本研究旨在对志贺菌属细菌的耐药机制做一综述。
- 穆瑞瑞蔺芳陈泽章段广才吴健
- 关键词：志贺菌属多重耐药耐药机制
- 幽门螺杆菌融合蛋白HspA-UreB在pMAL-C2x中的表达与免疫学活性研究被引量：1
- 2005年
- 目的:在pMAL-C2x中表达幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)融合蛋白HspA-UreB,探索其免疫学活性,为Hp基因工程疫苗的研究奠定基础。方法:从重组质粒pNHA27和pNUB27中纯化回收hspA和ureB基因片段,并以hspA-ureB的顺序连接后插入原核表达载体pMAL-C2x中,表达麦芽糖结合蛋白(MBP)与HspA-UreB的融合蛋白。采用亲和层析法纯化融合蛋白MBP-HspA-UreB,并辅以弗氏佐剂皮下免疫小鼠,蛋白印迹法对免疫小鼠血清进行检测。结果:特异PCR法和酶切鉴定证实融合基因hspA-ureB克隆入表达载体,并以融合蛋白形式MBP-HspA-UreB高效表达,相对分子量为119 000,约占细胞总蛋白的31%。通过大肠杆菌抗原吸收法纯化免疫小鼠血清后,与纯化的融合蛋白进行杂交,结果显示在119 000处出现特异杂交带。结论:融合蛋白HspA-UreB具有良好的免疫原性和免疫反应性。
- 代丽萍段广才范清堂张荣光
- 关键词：幽门螺杆菌免疫学
- 幽门螺杆菌HspA-UreB融合蛋白包涵体的纯化及活性鉴定被引量：4
- 2005年
- 目的 :建立一种有效的纯化幽门螺杆菌热休克蛋白 A亚单位 -尿素酶 B亚单位 (Hsp A- Ure B)融合蛋白包涵体的方法。方法 :基因工程重组大肠杆菌 BL2 1(p ET- HU2 7)诱导表达的 Hsp A- Ure B融合蛋白包涵体经洗涤、变性、复性 ,在 A¨ KTA FPL C上运用 Hi Trap Chelating HP分离纯化 ,用 SDS- PAGE和 Bradford法检测目的蛋白的纯度和含量 ,用 Western blotting对纯化后蛋白进行免疫学活性鉴定。结果 :纯化后 Hsp A- Ure B融合蛋白的纯度 >90 % ,含量达 0 .2 5 g· L- 1 ,并可以被 Hsp A- U re B融合蛋白免疫小鼠血清识别。结论 :成功地建立了从包涵体中纯化高纯度 Hsp A- U re B融合蛋白的方法。
- 纪晋文代丽萍段广才郗园林
- 关键词：螺杆菌热休克蛋白质类尿素酶重组融合蛋白质类包涵体
- 志贺菌主动外排泵acrAB-tolC及调控基因marOR突变与耐药的关系被引量：8
- 2010年
- 目的:研究志贺菌的耐药状况,检测临床分离志贺菌主动外排泵acrAB-tolC基因及调控基因marOR的突变情况,并探讨其与耐药性的关系。方法:对159株临床分离的志贺菌进行四环素、氯霉素、氨苄青霉素、庆大霉素、诺氟沙星、复方新诺明6种药物的药敏试验和有机溶剂耐受试验,对其acrAB-tolC基因和marOR基因进行聚合酶链反应(PCR)扩增,并进行限制性内切酶酶切与单链构象多态性(SSCP)分析。结果:159株临床分离的志贺菌属细菌筛选出4株敏感株、18株耐单药株和137株耐多药株,耐多药率为86.2%(137/159);159株中有122株对有机溶剂耐受,耐受率为76.7%(122/159);159株均扩增出acrAB-tolC基因和marOR基因,未发现基因缺失株;单链构象多态性分析,155株耐药菌株中,marOR基因的突变率为17.4%,acrA基因的突变率为5.8%,acrB基因的突变率为3.9%,tolC基因的突变率为2.6%;4株敏感株未发现marOR、acrA、acrB和tolC基因突变。结论:临床分离的志贺菌耐多药率和有机溶剂耐受率均较高,且存在较高的marOR基因突变率。
- 任静朝段广才宋春花吕锐利张卫东郗园林
- 关键词：志贺菌耐多药
- 实时荧光定量RT-PCR法对志贺菌外排泵基因emrE的表达分析被引量：3
- 2011年
- 测定临床耐多药志贺菌株H24的外排泵emrE基因的表达情况,尝试建立一个快速检测外排泵基因表达的方法。提取多耐药志贺菌株H24的RNA,用实时荧光定量RT-PCR方法验证H24的外排泵emrE基因mRNA表达水平和耐药的相关性。实时荧光定量RT-PCR获得H24的外排泵基因emrE的mRNA相对表达量,emrE基因的相对表达量为内参基因gapA的2万多倍;同一标本重复扩增,emrE和gapA基因相对拷贝数的平均变异系数分别为1.4%和1.3%,提示本方法可准确检测二者的相对拷贝数。由emrE基因的高表达可以推断它与志贺菌的多耐药有正相关性,这个推断结果与以前通过克隆emrE基因的方法得到的结果一致。所建立的emrE基因荧光定量RT-PCR诊断方法特异性好、敏感性高,SYBRGreenⅠ荧光定量RT-PCR可进一步应用于志贺菌多耐药株其他外排泵的临床诊断和科学研究。
- 穆瑞瑞朱凤荣段广才吴健
- 关键词：志贺菌外排泵荧光定量RT-PCR
- 幽门螺杆菌HspA-UreB融合蛋白可溶性表达产物的纯化及活性鉴定被引量：1
- 2004年
- 目的 :建立一种有效的纯化幽门螺杆菌HspA UreB融合蛋白可溶性表达产物的方法。方法 :基因工程重组大肠杆菌BL2 1(pET HU2 7)诱导表达产物 ,超声破碎后收集上清 ,上清经盐析初步纯化后 ,在 ¨AKTAFPLC上运用HiTrapChelatingHP分离纯化 ,用SDS PAGE和Bradford法检测目的蛋白的纯度和含量 ,用West ern blot对纯化后蛋白进行免疫学活性鉴定。结果 :纯化后HspA UreB融合蛋白的纯度 >90 % ,含量达 0 15mg/ml,并可以被免疫小鼠血清识别。结论 :建立了从BL2 1(pET HU2 7)可溶性表达产物中纯化高纯度HspA UreB融合蛋白的方法 ,为进一步的动物实验研究奠定了基础。
- 纪晋文代丽萍段广才郗园林
- 关键词：幽门螺杆菌纯化可溶性表达ET动物实验研究活性鉴定
- 幽门螺杆菌融合蛋白HspA-UreB在大肠杆菌中的表达与鉴定
- 2004年
- 目的在大肠杆菌中表达幽门螺杆菌(简称Hp)HspA-UreB融合蛋白,并探索其免疫反应性,为Hp基因工程疫苗的研制奠定基础。方法用PCR方法扩增郑州分离Hp菌株MEL-HP27的hspA和ureB基因,分别克隆入pNEB193中。测序后,回收两种基因片段,并以hspA-ureB的顺序连接插入原核表达载体pMAL-C2x进行融合表达。采用蛋白印迹法对表达产物进行鉴定。结果特异PCR法和酶切鉴定证实融合基因hspA-ureB克隆入表达载体中;重组质粒转化大肠杆菌TB1后,经IPTG诱导3h,SDS-PAGE电泳显示在119kDa处出现一条特异蛋白带,即麦芽糖结合蛋白(MBP)与HspA-UreB的融合表达形式,约占细菌总体蛋白含量的31%;该融合蛋白与Hp免疫小鼠血清和Hp阳性病人血清的Westernblot分析结果显示,在119kDa处出现特异杂交带。结论成功地在大肠杆菌中实现了Hp融合蛋白HspA-UreB的高效表达,并证实其具有良好的免疫反应性。
- 代丽萍段广才范清堂
- 关键词：幽门螺杆菌HSPAUREB融合蛋白基因表达
- 幽门螺杆菌HspA-UreB融合蛋白的诱导表达与活性鉴定被引量：1
- 2005年
- 目的:优化幽门螺杆菌HspA-UreB融合蛋白诱导表达的条件,以提高目的蛋白的产量。方法:表达幽门螺杆菌HspA-UreB融合蛋白的重组基因工程菌BL21(pET-HU27)在不同温度下(25℃、37℃)以不同的IPTG浓度(0.3、1.0和2.0 mmol.L-1)和不同的培养基(LB、SOC)中分别诱导表达不同时间,表达产物经超声破碎后,进行融合蛋白可溶性分析,并用Western blotting对表达产物进行鉴定。结果:SDS-PAGE结果显示,37℃时,LB培养基中,0.3 mmol.L-1的IPTG浓度诱导5 h时,融合蛋白的含量最高为21.51%;25℃,SOC培养基中,1.0 mmol.L-1的IPTG浓度诱导8 h时,可溶性HspA-UreB融合蛋白含量最高为34.58%,表达产物能够被免疫小鼠血清识别。结论:实现了幽门螺杆菌HspA-UreB融合蛋白在原核细胞中的高效表达,并具有良好的免疫活性,为进一步开发应用以该融合蛋白为抗原的幽门螺杆菌疫苗打下了坚实的基础。
- 纪晋文代丽萍段广才郗园林
- 关键词：螺杆菌基因表达包涵体
