黑龙江省自然科学基金(D200876)
- 作品数：4 被引量：11H指数：2
- 相关作者：毕郑钢袁绍辉韩晰光刘伟吴滨奇更多>>
- 相关机构：哈尔滨医科大学更多>>
- 发文基金：黑龙江省教育厅科学技术研究项目黑龙江省自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 人骨形态发生蛋白4成熟肽cDNA的克隆及测序
- 2011年
- 背景:研究表明骨形态发生蛋白4的骨诱导能力最强,但在组织中含量甚微。目的:克隆人骨形态发生蛋白4成熟肽基因。方法:从人胎盘组织中提取信使核糖核酸,根据基因库人骨形态发生蛋白4基因序列合成两条引物,利用一步法反转录聚合酶链式反应技术扩增出人骨形态发生蛋白4成熟肽的基因序列,将聚合酶链反应扩增产物基因片段连接克隆载体质粒中转化大肠杆菌DH5α进行克隆筛选鉴定及测序。结果与结论:琼脂糖凝胶电泳检测反转录聚合酶链式反应产物及阳性克隆质粒经双酶切产物显示一长约370bp的条带,脱氧核糖核酸测序结果与基因库中的序列相符。结果证实,利用反转录聚合酶链式反应技术可成功的从人胎盘组织中克隆出人骨形态发生蛋白4成熟肽基因。
- 袁绍辉刘伟吴滨奇韩晰光毕郑钢
- 关键词：骨形态发生蛋白克隆胎盘
- 重组骨形成蛋白4/7融合基因腺相关病毒载体的构建与鉴定被引量：1
- 2011年
- 背景:有研究表明骨形成蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)异源二聚体比同源二聚体的活性高20倍,但相关BMP4/7融合基因的相关病毒载体的构建至今少有报道。目的:构建重组人BMP-4/7融合基因腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)载体并检测其表达。方法:扩增BMP-4、7成熟肽基因;分别构建质粒pGEM-BMP-4和pGEM-BMP-7;采用DNA连接法获取BMP-4/7融合基因,克隆获得pGEM-BMP-4/7质粒,进行基因测序。AAV颗粒转染HEK293细胞,收获病毒载体AAV-BMP-4/7。用SDS-PAGE电泳检测BMP-4/7融合基因蛋白在大肠杆菌的表达。用不同感染复数的AAV-BMP-4/7转染骨髓间充质干细胞3d,提取细胞总RNA和总蛋白,进行RT-PCR和ELISA法检测融合基因BMP-4/7在骨髓间充质干细胞中的表达。结果与结论:PCR电泳,酶切鉴定及测序结果表明,装入pSNAV质粒中的BMP-4/7基因正确,pSNAV-BMP-4/7重组成功。RT-PCR检测到骨髓间充质干细胞BMP-4/7融合基因的转录条带,ELISA检测显示经AAV转染的骨髓间充质干细胞中BMP-4/7蛋白随着感染复数的增加表达逐渐增高(P<0.01)。结果证实,实验成功构建重组骨形成蛋白4/7融合基因腺相关病毒载体。
- 袁绍辉刘伟吴滨奇韩晰光毕郑钢
- 关键词：重组人骨形成蛋白融合基因腺相关病毒骨组织工程
- RNAi对骨肉瘤细胞株HMGA1基因表达及侵袭力抑制的实验研究被引量：5
- 2010年
- 目的:探讨RNA干扰(RNAi)技术对骨肉瘤细胞株(MG-63)中HMGA1基因表达和侵袭力的影响。方法:采用单细胞克隆技术,从MG-63中分离培养出高表达HMGA1的骨肉瘤细胞株,将细胞分成3组,通过pU6mRFP载体进行转染:实验组,转染HMGA1的小干扰RNA(siRNA);阴性对照组,转染HMGA1的无关序列;细胞对照组为未转染的MG-63细胞。转染细胞株后,荧光检测转染效率;用实时荧光定量RT-PCR和蛋白质印迹法分别从mRNA和蛋白质水平检测siRNA对HM-GA1表达的影响;Transwell趋化侵袭实验观察转染后细胞株侵袭能力的变化。结果:荧光检测转染效率,实验组为(55.68±6.74)%,阴性对照组为(49.87±4.33)%;细胞对照组观察不到明显的荧光细胞。实验组HMGA1siRNA转染骨肉瘤细胞后,明显下调细胞中HMGA1mRNA及蛋白的表达,与转染时间和转染浓度相关;阴性对照组和细胞对照组在转染前后HMGA1基因的mRNA及蛋白质表达均无明显变化。实验组细胞株穿过侵袭膜的细胞数明显低于阴性对照组和细胞对照组,P<0.01。结论:HMGA1siRNA可以下调骨肉瘤细胞中HMGA1mRNA及其蛋白的表达,抑制骨肉瘤细胞侵袭能力。
- 袁绍辉潘琦尚剑曹阳付春江毕郑钢
- 关键词：基因肿瘤抑制肿瘤基因表达
- 骨形态发生蛋白4和骨形态发生蛋白4/7基因转染对骨髓基质干细胞成骨活性差异的比较被引量：5
- 2011年
- 背景:有文献报道骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)异源二聚体比同源二聚体的活性高,目前国内外尚无BMP-4/7异源二聚体与BMP-4同源二聚体间诱导成骨活性比较的报道。目的:观察不同基因BMP-4、BMP-4/7对骨髓基质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)成骨活性的差异,探讨融合基因BMP-4/7的生物学活性。方法:经脂质体转染分离培养的兔BMSCs,G418筛选出稳定表达株,利用RT-PCR法证明目的基因在BMSCs中的表达情况;以BMP-4和BMP4/7融合基因修饰的AAV载体,转染兔BMSCs,MTT法检测不同基因转染细胞的增殖能力;以BMP-4单基因和BMP-4/7融合基因修饰的AAV载体转染兔BMSCs7d后,测定两组细胞内碱性磷酸酶及骨钙素水平,观察成骨活性的变化。结果与结论:实验成功构建高滴度的分别携带BMP-4单基因、BMP-4/7融合基因的重组腺相关病毒载体AAV-BMP-4、AAV-BMP-4/7;RT-PCR结果证明目的基因能够在BMSCs中得到稳定表达。AAV-BMP-4及AAV-BMP-4/7载体转染效率分别为68.20%、72.18%;转染BMSCs后,细胞增殖能力均明显提高,BMP-4/7融合基因的细胞增殖能力活性高于BMP-4单基因。以BMP-4和BMP-4/7融合基因修饰的AAV转染细胞7d后,细胞内碱性磷酸酶活性明显上调,骨钙素水平升高,成骨活性均增强;两种基因比较,BMP-4/7融合基因成骨活性强于BMP-4单基因(P<0.01)。提示BMP-4、BMP-4/7修饰的AAV载体转染效率高,对BMSCs均有成骨活性,其中BMP-4/7融合基因成骨活性强于BMP-4单基因。
- 袁绍辉刘伟吴滨奇韩晰光毕郑钢
- 关键词：骨髓基质干细胞骨形态发生蛋白融合基因腺相关病毒成骨活性
