国家自然科学基金(30872405)
- 作品数：8 被引量：13H指数：2
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- 相关机构：第二军医大学安徽医科大学安庆医药高等专科学校更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家高技术研究发展计划上海市科学技术委员会基础研究重点项目更多>>
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- HIV-1 HXB2株Tat半胱氨酸富集区N端移位突变体的构建及在大肠杆菌中的高效表达
- 2009年
- 目的构建HIV-1HXB2株Tat半胱氨酸富集区N端移位突变体,并在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中进行高效表达和纯化。方法应用PCR拼接的方法将首轮合成Tat基因的半胱氨酸富集区(64～111位核苷酸,22～37位氨基酸)移位至缺失半胱氨酸富集区的Tat(△C)的N末端,获得其突变体序列(Tat(CN)DNA),构建其原核表达质粒pET32a-Tat(CN),并转入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中进行诱导表达及纯化,经SDS-PAGE鉴定表达及纯化产物,纯化后的产物用间接ELISA进行鉴定。结果构建了pET32a-Tat(CN)突变体,pET32a-Tat(CN)融合蛋白在大肠杆菌中表达水平为5.17mg/ml,相对分子质量为31ku。间接的ELISA结果表明,pET32a-Tat(CN)能与Tat兔抗血清呈特异反应。结论成功构建了HIV-1 HXB2株Tat半胱氨酸富集区移位至TatN端的突变体,并能在大肠杆菌中高效表达,其纯化的蛋白pET32a-Tat(CN)很好地保留了与HIV-1Tat兔抗血清的免疫反应性,为HIV-1Tat的疫苗基础研究提供了一有价值的研究结论。
- 李存枚潘卫曹洁王锦红黄德圣庞强廖文婷邓松华
- 关键词：TAT
- 不同亚类小鼠IgG对SpA和SpG单结构域构成的随机组合噬菌体文库的体外进化研究被引量：1
- 2014年
- 目的判断不同亚类小鼠IgG Fc段构像及与SpA或SpG的结合特点,采用不同亚类小鼠IgG对SpA和SpG单结构域构成的随机组合噬菌体展示文库进行亲和筛选。方法不同亚类小鼠IgG对噬菌体文库进行亲和筛选,获得具有结合优势的单结构域排列组合,噬菌体ELISA法来比较其与不同亚类小鼠IgG的结合特性,优势组合分子经原核表达蛋白,HRP标记后,ELISA法进一步来比较其与小鼠不同亚类IgG的结合特性。结果小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3分别经过5、4、5和5轮亲和筛选后,其文库的展示片段大小均为2个domain,表明进化完全。测序分析显示:小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3筛选得到的具有结合优势组合分子分别是D-D、D-D、A-C和D-C。噬菌体ELISA验证结合优势组合分子对小鼠不同亚类IgG的结合能力;蛋白经HRP标记后的ELISA结果和筛选不完全一致,但其结合强弱具有一致性,均为:IgG3>IgG2a>IgG2b>IgG1。结论得到3种不存在于天然SpA、SpG分子中,分别与不同亚类小鼠IgG具有较强结合作用的新型组合分子D-D、A-C和D-C,为进一步研究IgG Fc段构像及与SpA或SpG的结合特点提供了新的参考分子。
- 徐文竹丁莹莹吴莉莉张婧冯娇娇王锦红潘卫邓松华
- 关键词：噬菌体文库定向进化亚类
- 人和羊IgG对噬菌体展示细菌免疫球蛋白结合分子单结构域随机组合文库的体外进化筛选被引量：1
- 2013年
- 目的使用人和羊不同物种IgG来诱导噬菌体展示免疫球蛋白结合分子单结构域随机组合文库进行体外分子进化筛选,判断不同的Fc段构像是否具有特异的结合优势,同时探索其优势结合序列的组合特点。方法通过PCR获得金黄色葡萄球菌蛋白A(SpA)的A、B、D、E和链球菌(C和G群)蛋白G(SpG)的B2、B3各单结构域片段,构建由该6个片段随机组合的噬菌体展示文库。再分别使用人和羊IgG对文库进行体外亲和筛选,以期能够获得具有特异优势结合能力的组合分子,并在Phage ELISA的水平上进一步验证筛选结果。结果成功构建了符合进行体外进化筛选要求的噬菌体展示单结合结构域随机组合文库后,经过6轮人IgG诱导筛选,文库的展示片段大小统一为3个结构域组合分子,E-B-B3;经过6轮羊IgG诱导筛选,文库的展示片段大小也统一为4个结构域组合分子,D-A-B3-B3。Phage ELISA进一步验证最终组合序列的对人和羊IgG的结合能力。结论首次得到两种天然SpA、SpG分子中不存在的,且分别特异地与人和羊IgG具有强结合作用的新型组合分子E-B-B3、D-A-B3-B3,在人和羊IgG的纯化和检测具有很大的应用前景。
- 吴莉莉祁培培章萍萍王锦红张婧何婷潘卫邓松华
- 关键词：细菌噬菌体免疫球蛋白G基因文库
- 人精液源性病毒感染增强因子研究进展被引量：2
- 2010年
- 人精液前列腺酸性磷酸酶（prostatic acid phosphatase, PAP）多肽片段形成的淀粉样原纤维具有促进人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus, HIV）感染的作用，这些原纤维被称为精液源性病毒感染增强因子（semen-derived enhancer of viral infection, SEVI），其中PAP第248—286位多肽片段（PAP248-286）促进HIV感染的作用最强。具有阳离子特性的SEVI可通过静电作用捕获HIV颗粒而促进HIV感染。近期研究报道，SEVI对异嗜性小鼠白血病病毒相关病毒感染也有增强作用，可能与前列腺癌发生有关。某些多聚阴离子化合物和绿茶多酚成分能明显抑制SEVI活性。研究SEVI生物学特性及其功能对于HIV等病毒感染的防治具有重要意义。
- 张华群曹洁潘卫
- 关键词：HIV感染静电作用前列腺酸性磷酸酶
- SPA单结构域突变体组合噬菌体文库的构建及体外进化筛选被引量：1
- 2015年
- 目的使用人免疫球蛋白G(IgG)对金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)单结构域突变体组合文库进行体外分子进化筛选,判断不同突变体组合的特异结合优势,探索优势组合分子结构与功能间的关系。方法通过Overlap PCR获得SPA中A和C单结构域突变体片段组合构成的噬菌体文库,再使用人IgG对文库进行体外亲和筛选,期望通过对特定结合分子的定向改造及体外进化获得具有高结合优势的组合分子。结果成功构建符合体外筛选要求的SPA单结构域A在29、30位氨基酸定点突变文库(A1)、SPA单结构域C在36、37位定点突变文库(C1)和SPA单结构域A在37位后插入3个氨基酸随机肽(AI37)、SPA单结构域C在20位后插入3个随机连接肽(CI20),将A1、C1随机组合构建的噬菌体展示文库命名为库A1C1,将AI37、CI20随机组合构建的噬菌体展示文库命名为库AI37CI20。两个文库各自经过4、5轮亲和筛选,文库进化完全。Phage-ELISA高光密度值的单克隆,测序结果分析为A(Q29K30)A(I29I30)和AI-TQSA。结论通过定向改造技术获得了高结合能力的定点突变分子A(Q29K30)A(I29I30)和插入突变分子AI37-TQSA,为Ig结合分子的定向改造及具有新的Ig结合特性的重组Ig结合分子的进一步研究奠定了基础。
- 林子玉丁莹莹周鹏高彩霞冯娇娇王锦红潘卫邓松华
- 人类免疫缺陷病毒1型HXB2株Tat突变体的构建、原核表达及免疫原性分析
- 2009年
- 目的构建HIV一1HXB2株Tat基因半胱氨酸富集区3’末端移位突变体，经原核表达和纯化，分析该突变体蛋白（Tat—cct）的免疫原性。方法用PCR方法将HIV一1HXB2株Tat基因的半胱氨酸富集区（64～111位核苷酸）移位至Tat基因的3’末端，获得其突变体DNA序列，并构建其原核表达质粒pET32a—Tat—oct，转人大肠埃希菌E．coliBL21（DE3）中进行诱导表达及纯化。以Tat—cct融合表达蛋白免疫BALB／c小鼠，ELISA方法对该抗血清进行免疫原性检测分析。结果pET32aTat—cct重组质粒可在E．coliBI。21（DE3）中诱导表达，纯化后其融合蛋白相对分子质量约为31000。Tat—cct重组蛋白免疫小鼠诱导产生的抗体滴度为1：1600，该抗体与Tat—cot蛋白和Tat蛋白（1～101位氨基酸）均呈特异性结合反应。结论Tat突变体重组蛋白Tat—cct能在大肠埃希菌中有效表达，并较好保留其免疫原性，为HIV一1Tat疫苗的基础研究提供了有价值的实验结论。
- 李存枚邓松华曹洁王锦红陈璐黄德圣潘卫
- 关键词：HIV-1基因产物TAT重组蛋白质类免疫
- 结核分枝杆菌特异性蛋白片段Rv3388和6种特异抗原在结核抗体检测中的应用价值被引量：7
- 2015年
- 目的 对结核分枝杆菌（ MTB） PE家族的所有成员的结构进行分析,预测其抗原表位,截取Rv3388蛋白的优势抗原片段,对重组Rv3388蛋白及其它6种MTB特异性抗原进行评估,探讨不同结核特异性抗原与血清抗体的反应模式,评价血清学检测在结核病诊断中的价值. 方法 利用基因合成技术重叠延伸PCR扩增Rv3388蛋白637-731位的编码基因片段, 原核表达并纯化重组蛋白pET32a/Rv3388637-731 ,将纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,采用间接ELISA法对该抗血清进行免疫原性分析. 同时对这7种MTB特异性蛋白的特异性及敏感性进行评价. 结果 重组蛋白pET32a/Rv3388637-731在大肠杆菌中的表达量占全菌蛋白的80%,ELISA显示有较强的免疫原性. 7 种 MTB特异性抗原具有不同的反应模式,单个抗原检测敏感性较差. 结论 对MTB PE家族的蛋白结构分析,表达并纯化重组蛋白pET32a/ Rv3388637-731 ,7种蛋白在血清抗体检测中具有抗原互补性,不同抗原与机体反应存在不同反应模式,提高结核抗体检测敏感性应多种抗原联合检测.
- 周鹏丁莹莹林子玉冯娇娇高彩霞王锦红杨华温宗梅潘卫邓松华
- 关键词：结核分枝杆菌特异性敏感性
- 用兔IgG筛选噬菌体展示免疫球蛋白结合分子组合文库被引量：1
- 2009年
- 目的应用噬菌体展示免疫球蛋白(Ig)结合分子组合文库,进化筛选获得与兔IgG结合的代表性序列,测定其与兔IgG及人IgG结合活性的差异,以判断筛选获得的代表性序列对不同种属Ig的结合是否存在倾向性的差别。方法应用包含Ig效应子结合蛋白Protein A的D结构域(PA-D)、A结构域(PA-A),Protein G的B2结构域(PG-B2)及protein L的B3结构域(PL-B3)的单结构域随机组合文库,以兔IgG对该组合文库进行进化筛选,序列比较分析筛选获得的代表性序列与人IgG进化筛选文库所得代表性序列的异同性;用ELISA和竞争抑制试验分别测定阳性噬菌体克隆与兔IgG及人IgG的结合活性。结果以兔IgG经4轮分子进化筛选,获得在天然细菌蛋白中不存在的新的结构形式PA-A—PA-A,该结果与人IgG进化筛选所得代表性序列PA-A—PG有显著差异;兔IgG筛选序列PA-A—PA-A和人IgG筛选序列PA-A—PG分别显示出与兔Ig和人Ig结合力更强的特性。结论该研究首次应用噬菌体展示技术研究不同种属抗体效应子构象的不同,证实兔IgG和人IgG两者效应子构象之间确实存在差异。这一结论有助于阐明抗体效应子构象在不同种属之间的差异性。
- 唐萍潘卫曹洁廖文婷陈秋莉黄德圣庞强王锦红邓松华
- 关键词：免疫球蛋白类免疫球蛋白G
