国家自然科学基金(30870096)
- 作品数：9 被引量：8H指数：1
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- 相关机构：江苏大学江苏大学附属人民医院北华大学更多>>
- 发文基金：江苏省高校自然科学研究项目国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 幽门螺杆菌Cag致病岛hp0527基因的缺失株构建和鉴定被引量：1
- 2009年
- 目的:构建幽门螺杆菌(H.pylori)Cag致病岛编码hp0527基因的突变株。为Cag致病岛致病机制及H.pylori功能研究奠定基础。方法:利用基因同源重组方法将卡那霉素抗性基因(KanR)连接到PCR扩增hp0527两端区域产生的2个目的基因片段之间,构建hp0527基因缺失的自杀质粒pBlueKM40-Δhp0527;将带有卡那霉素抗性标志的缺失突变载体,通过抗生素卡那霉素筛选出缺失hp0527基因的突变株,并经PCR方法鉴定后,采用野生株和突变株的幽门螺杆菌分别与胃癌上皮细胞BGC-823共培养后,分析它们对细胞毒素相关蛋白CagA转运能力的影响。结果:成功构建出幽门螺杆菌hp0527基因突变的自杀质粒,突变载体经内切酶酶切分析显示:产生的条带与设计结果完全一致;抗生素筛选并经PCR鉴定后,获得了hp0527基因缺失株;CagA蛋白转运分析表明基因hp0527缺失前后,可以导致细菌转运CagA蛋白能力的丧失。结论:成功构建出1株缺失hp0527基因的H.pylori突变株,对于阐明该基因的功能及其在H.pylori致病中的地位及作用具有重要的研究价值。
- 母润红邵世和钟桥韩军黄河田树伟
- 关键词：幽门螺杆菌同源重组突变体
- 幽门螺杆菌Ⅳ型分泌系统cagM基因的克隆、表达及抗体制备被引量：1
- 2010年
- 目的：构建表达幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,H.pylori）NCTC 11637 IV型分泌系统cagM（HP0537）全长编码基因的原核表达载体,分析其抗原性并制备抗体。方法：应用PCR技术从H.pylori基因组扩增cagM基因片段,TA克隆后测序分析,并构建表达载体pET-28a（＋）-cagM,转化E.coliBL21,IPTG诱导表达,SDS-PAGE及鉴定表达蛋白,表达蛋白以Ni2＋-NTA柱进行纯化,用软件分析其抗原性后,免疫家兔制备多克隆抗体,ELISA检测多克隆抗体效价。结果：测序结果表明cagM基因全长1 131 bp（基因库登录号为GU269568）,编码376个氨基酸,与基因库中已知菌株J99,26695和G27的氨基酸同源性为98%~99%;诱导表达后经SDS-PAGE检测表明,在43 700处发现一条新生条带,Ni2＋-NTA柱纯化后为单一条带,软件分析表明其抗原性较强,免疫家兔制备的多克隆抗体效价为1∶1.6×105。结论：首次成功克隆并表达了H.pyloripNCTC 11637cagM基因,并制备了其抗体,为以后进一步研究其生物学功能以及H.pylori相关疾病的检测与治疗奠定了基础。
- 田树伟邵世和韩军黄河黄世腾
- 关键词：幽门螺杆菌抗体
- 幽门螺杆菌cag4蛋白的原核表达、纯化及鉴定被引量：4
- 2011年
- 目的:构建幽门螺杆菌cag4蛋白的原核重组体系,表达、纯化融合蛋白。方法:利用PCR技术从幽门螺杆菌NCTC11637中克隆了cag4基因;经T-A克隆,酶切鉴定,构建了原核表达载体pET-28a-cag4;经测序鉴定正确后,转化进入大肠埃希菌BL21(DE3)进行异源表达。利用IPTG体外诱导后,经SDS-PAGE和Western bolt鉴定目的蛋白表达后,采用Ni2+-NTA柱在变性条件下纯化目的蛋白,并对重组蛋白进行透析复性处理。将SDS煮沸法获得的溶壁微球菌肽聚糖掺入SDS-PAGE作为底物,进行酶谱分析。结果:成功扩增了cag4基因基因;重组质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中诱导表达出pET-28a-cag4融合蛋白;优化了pET-28a-cag4原核表达体系的最适条件;Western bolt分析结果显示表达的基因重组蛋白与目的蛋白相符;酶谱分析显示其具有明显的肽聚糖水解活性。结论:幽门螺杆菌cag4蛋白具有溶菌糖基转移酶活性。
- 王文凯钟桥谢立苹邵世和
- 关键词：原核表达纯化融合蛋白
- 幽门螺杆菌Cag致病岛hp0523基因的缺失及其对CagA蛋白转运能力的影响
- 2009年
- 【目的】构建幽门螺杆菌Cag致病岛编码的hp0523基因缺失株,为研究hp0523基因的功能奠定基础。【方法】本研究利用同源重组原理,设计并扩增了hp0523基因上下游同源臂片段,构建hp0523基因缺失自杀质粒pBlueKM40-Δhp0523,电击转化进入幽门螺杆菌后,通过抗生素筛选后并经PCR验证无误后,获得hp0523基因缺失株H.pylori11637Δhp0523;采用幽门螺杆菌与胃癌上皮细胞BGC-823共培养后,分析该基因缺失前后对细胞毒性蛋白CagA转运能力的影响;并分析比较了缺失前后,CagA蛋白的表达能力变化;【结果】构建幽门螺杆菌hp0523基因缺失的自杀质粒,并成功获得一株hp0523基因缺失株;CagA转运实验表明,hp0523基因缺失后,可以导致细菌转运CagA蛋白的能力丧失;此外,还发现hp0523基因缺失可以影响CagA蛋白表达。【结论】成功获得了幽门螺杆菌hp0523基因缺失株,初步研究发现hp0523基因是幽门螺杆菌Cag致病岛中重要致病因子之一,参与CagA蛋白的转运,可能是其转运装置中组成成分之一。
- 钟桥邵世和母润红王华黄世腾韩军黄河田树伟
- 关键词：幽门螺杆菌CAG致病岛同源重组
- 幽门螺杆菌Cag致病岛hp0540基因的克隆表达及其多克隆抗体的制备
- 2010年
- 目的:构建幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)Cag致病岛(Cag-pathogenicity island,Cag-PAI)编码的hp0540基因的原核表达系统,并制备其多克隆抗体。方法:应用PCR技术从Hp11637基因组DNA中扩增hp0540基因片段,克隆至pMD18-2T载体后,进行序列测定,并对其序列进行生物信息学分析;构建pET-28a-hp0540原核表达载体,转化表达宿主菌BL21DE3;经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE法鉴定目的蛋白的表达,并以Ni2+-NTA柱分离纯化目的蛋白;将纯化蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体并测定抗体效价。结果:成功克隆了hp0540基因,全长1 086 bp,编码361个氨基酸,与基因库公布的其他Hp菌株基因序列的核苷酸同源性为98%。工程菌诱导后SDS-PAGE显示新生表达蛋白带,相对分子质量约为39 000,经Ni2+-NTA柱纯化后可获得重组蛋白,重组蛋白免疫新西兰大白兔后获得效价为1∶160 000的多克隆抗体。结论:成功构建了hp0540基因的原核表达系统并制备了其多克隆抗体,为研究该基因的功能奠定了基础。
- 韩军邵世和谢立苹黄世腾田树伟黄河
- 关键词：幽门螺杆菌CAG致病岛多克隆抗体
- 幽门螺杆菌Ⅳ型分泌系统cagX基因缺失株的构建与鉴定被引量：1
- 2011年
- 目的:构建幽门螺杆菌(H.pylori,Hp)IV型分泌系统cagX基因缺失株,为研究cagX基因的功能奠定基础。方法:利用基因同源重组原理,设计cagX基因上下游同源臂片段,应用PCR扩增目的基因片段,TA克隆后酶切鉴定,将纯化后的同源臂片段连接到含卡那霉素抗性基因的载体pBluescript SKⅡ(-),即cagX基因自杀质粒pBlueKM40-ΔcagX;自杀质粒电击转化HpNCTC 11637,通过卡那霉素筛选基因缺失株,后经PCR和DNA测序鉴定。结果:构建成功了幽门螺杆菌cagX基因自杀质粒,并转化至HpNCTC 11637内。结论:成功获得了幽门螺杆菌cagX基因缺失株Hp11637-ΔcagX。
- 高小焕邵世和段秀杰谢立苹
- 关键词：幽门螺杆菌同源重组基因缺失
- 幽门螺杆菌Cag-PAI hp0523基因的克隆及功能预测被引量：1
- 2009年
- 目的：明确幽门螺杆菌Cag-PAIhp0523基因的功能，探讨其在幽门螺杆菌致病中的作用。方法：设计引物，以幽门螺杆菌NCTC11637为模板，采用聚合酶链反应（PCR）扩增获得目的片段；将其进行T-A克隆后，进行测序。将该基因序列与其他菌株做BLAST比对分析，并结合生物信息学数据库和软件，分析其序列特征和理化特性。结果：经酶切，测序分析表明，插入的基因片断为510 bp，与基因库公布的幽门螺杆菌26695及J99序列相比较，同源性高达94%；软件预测其编码的蛋白为169个氨基酸，其相对分子质量约为19.7 kDa，等电点约为9.53；基序分析表明，在33-165位氨基酸之间存在一个保守的SLT催化基序，可能是溶菌糖基转移酶；对其催化能力进行预测，结果表明，HP0523（33.7%）催化能力可能较T4溶菌酶（32.3%）和溶菌酶SLT70（28.6%）的活性高。结论：成功克隆了幽门螺杆菌Cag-PAI的hp0523基因，对其序列进行了深入分析，为进一步研究其功能，阐明幽门螺杆菌Cag-PAI的致病机制奠定了基础。
- 邵世和钟桥黄世腾韩军黄河田树伟
- 关键词：幽门螺杆菌CAG致病岛
- 幽门螺杆菌外膜蛋白cagL基因的克隆、表达及其对IL-8 mRNA表达的影响
- 2010年
- 目的：克隆表达幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,H.pylori）NCTC11637菌株cagL基因,并探讨其对IL-8mRNA表达的影响。方法：设计cagL引物,应用PCR扩增目的基因片段,TA克隆后测序分析,用信息学软件分析其物理化学特性,并构建表达载体cagL-PET28 a（＋）转化E.coliBL-21（DE3）,IPTG诱导表达,镍亲和层析纯化,SDS-PAGE及蛋白质印迹鉴定表达蛋白。纯化蛋白与细胞GES-1共培养,提取细胞总RNA,RT-PCR检测细胞IL-8mRNA表达。结果：测序分析表明cagL编码成熟肽的碱基序列为654 bp,编码217个氨基酸,与基因库公布的其他H.pylori菌株的基因序列同源性为96%~98%,氨基酸同源性为97%~99%,软件预测显示有多个明显的具有抗原活性的结构域;表达蛋白的相对分子质量约为32 000,蛋白质印迹检测融合蛋白具有良好的抗原活性;重组蛋白作用于GES-1细胞后,可诱导细胞因子IL-8在mRNA水平上的表达。结论：CagL蛋白可刺激GES-1细胞IL-8 mRNA的表达。
- 黄世腾邵世和韩军黄河田树伟
- 关键词：原核表达白细胞介素-8
- 异源表达的幽门螺杆菌cag4蛋白有溶菌糖基转移酶活性
- 2011年
- 【目的】构建融合基因原核表达载体pET-28a-cag4,并表达重组融合蛋白cag4,分析重组融合蛋白的酶活性,为新型抗生素(或是抗菌药物)的研发提供作用靶位。【方法】本研究利用PCR技术从幽门螺杆菌NCTC11637中克隆了cag4基因;经T-A克隆,酶切鉴定,构建了原核表达载体pET-28a-cag4;经测序鉴定正确后,转化进入大肠埃希菌BL21(DE3)进行异源表达。利用IPTG体外诱导后,经SDS-PAGE和WesternBolt鉴定目的蛋白表达后,采用Ni2+-NTA柱在变性条件下纯化目的蛋白,并对重组蛋白进行透析复性处理。将SDS煮沸法获得的溶壁微球菌肽聚糖掺入SDS-PAGE作为底物,进行酶谱分析。【结果】在大肠埃希菌BL21(DE3)中获得高效表达的重组蛋白;经SDS-PAGE和Western Bolt鉴定表达后,采用Ni2+-NTA柱在变性条件下纯化,并进行透析复性处理。将SDS煮沸法获得的溶壁微球菌肽聚糖掺入SDS-PAGE作为底物,进行酶谱分析,表明目的蛋白具有明显的肽聚糖水解活性;通过监测浊度下降速率,比较其在不同pH条件下活性的变化,即ΔA/(min.mg protein),结果表明,幽门螺杆菌cag4蛋白具有溶菌糖基转移酶活性。【结论】幽门螺杆菌cag4蛋白具有溶菌糖基转移酶活性。
- 王文凯钟桥谢立苹邵世和
- 关键词：幽门螺杆菌异源表达酶谱分析
