国家自然科学基金(30872417)
- 作品数：10 被引量：25H指数：3
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- 相关机构：重庆医科大学海南医学院重庆医科大学附属第一医院更多>>
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- 相关领域：医药卫生生物学电子电信更多>>
- Y-盒结合蛋白-1基因对人乳腺癌细胞株MDA-MB-231增殖、凋亡及侵袭能力的影响被引量：2
- 2012年
- 目的观察Y-盒结合蛋白-1(Y-box binding protein-1,YB-1)基因对人乳腺癌细胞株MDA-MB-231增殖、凋亡及侵袭能力的影响。方法通过脂质体介导的方法将YB-1 shRNA重组质粒pGSi2和阴性对照质粒HK转染MDA-MB-231细胞,采用RT-PCR和Western blot法检测细胞中YB-1、基质金属蛋白酶-2(Matrix metalloproteinase-2,MMP-2)、MMP-9在mRNA和蛋白水平的表达;MTT法及流式细胞术检测细胞增殖活力、细胞周期及凋亡的变化;Transwell小室法检测细胞侵袭能力的变化。结果 pGSi2组MDA-MB-231细胞较HK组细胞YB-1 mRNA及蛋白的表达水平均明显降低(P<0.01);沉默YB-1表达可以抑制MDA-MB-231细胞增殖,诱导其凋亡,且细胞侵袭能力及MMP-2和MMP-9的表达也较HK组明显下降(P均<0.05)。结论YB-1 shRNA可以沉默MDA-MB-231细胞中YB-1的表达,抑制细胞增殖,诱导其凋亡,并抑制细胞侵袭能力及MMP-2和MMP-9的表达。
- 邱欣欣涂植光孔飞飞陈光辉成凤匡文斌钟梁
- 关键词：RNA干扰乳腺癌基质金属蛋白酶类
- 新型二聚体突变荧光引物定量PCR方法的建立及其在检测HCV中的应用被引量：3
- 2011年
- 目的开发新型二聚体突变荧光引物技术，建立一种能广泛应用于临床检测HCV的实时PCR方法。方法构建重组质粒pMD18-T—HCV5’NCR作为标准品，设计二聚体突变荧光引物，优化定量PCR体系，并进行方法学评价。将本法应用于临床确诊的30份HCV阳性患者、30份其他病毒性肝炎患者和30份健康志愿者血清标本的检测，定量结果与商品化TaqManHCV定量试剂盒的定量结果进行比较。结果建立了利用二聚体突变荧光引物的实时PCR方法，检测的线性范围为20-10^9IU／ml；批内CV在1．37％-4．59％之间，批间CV在1．58％-4．81％之间；对所有其他病毒性肝炎患者和健康志愿者血清HCV的检测结果均阴性，检测特异性为100％（60／60）；对临床确诊的HCV感染患者血清标本全部检出HCV阳性，定量结果与商品化TaqManHCV定量试剂盒的定量结果具有很好的相关性，相关系数R2=0．9501。结论建立的以二聚体突变荧光引物为平台的HCV实时PCR检测方法，具有快速、价廉、准确、结果可靠等特点，可为HCV感染的诊断、治疗监测和流行病学调查提供较好的技术支持。
- 夏乾峰文阳安刘靳波李朴涂植光
- 关键词：肝炎病毒属聚合酶链反应RNA病毒
- 重组腺病毒Ad5-hNK4-EGFP的构建与鉴定被引量：3
- 2012年
- 目的构建携带绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)标签和hNK4基因的重组腺病毒Ad5-hNK4-EGFP,并检测其对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的影响。方法以pcDNA3/hNK4质粒为模板,采用高保真DNA聚合酶扩增hNK4基因,克隆至腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,构建重组穿梭质粒pAdTrack-hNK4,穿梭质粒经PmeⅠ酶切线性化,与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组,获得重组腺病毒质粒pAd5-hNK4-EGFP,经PacⅠ酶切线性化后转染AD-293细胞进行包装,获得重组腺病毒Ad5-hNK4-EGFP,经4轮扩增后,测定病毒滴度;将重组腺病毒感染AD-293细胞,采用RT-PCR及Western blot法检测感染细胞中NK4基因的转录及蛋白的表达;MTT法检测Ad5-hNK4-EGFP对肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor,HGF)诱导的MDA-MB-231细胞增殖的影响。结果重组腺病毒质粒pAd5-hNK4-EGFP经PacⅠ酶切鉴定证明构建正确;经包装及4轮扩增后,重组腺病毒Ad5-hNK4-EGFP的滴度可达1.5×1011PFU/ml;经RT-PCR及Western blot鉴定表明,重组腺病毒携带的NK4基因能够在AD-293细胞中表达;HGF可促进MDA-MB-231细胞增殖,而Ad5-hNK4-EGFP可拮抗HGF诱导的MDA-MB-231细胞增殖。结论成功构建了表达hNK4基因的重组腺病毒Ad5-hNK4-EGFP,其可拮抗HGF诱导的MDA-MB-231细胞的增殖,为进一步深入研究HGF和NK4的功能、相互作用及作用机制奠定了基础,也为乳腺癌的靶向基因治疗提供了一个新的靶点。
- 匡文斌成凤秦晓林范晓卿王秦董晋豫梁勤东涂植光
- 关键词：腺病毒肝细胞生长因子NK4
- 人YB-1的高效原核表达及其标准蛋白与抗血清的制备被引量：1
- 2011年
- 目的:构建YB1-GST表达系统,建立经济高效YB-1蛋白制备方法并制备其多抗。方法:将YB-1编码序列亚克隆至表达载体pGEX-6P-1;转化表达菌并确定可溶性表达最佳条件;采用GST亲和层析与层析柱上PSP酶切融合蛋白获取无标签蛋白的YB-1,经超滤浓缩及Western blot鉴定后,进一步真空冷冻干燥,制备YB-1标准蛋白;采用大剂量YB-1长程免疫方案免疫家兔以制备其抗体。结果:成功构建了表达载体pGEX-YB1;SDS-PAGE结果显示,YB1-GST融合蛋白以可溶性表达为主;Western blot结果证实,表达产物经GST亲和层析、PSP酶切以及真空冷冻干燥后获得了纯度较高的YB-1标准蛋白,将该蛋白免疫家兔获得了较高效价与特异性的抗体。结论:建立了YB-1-GST表达系统与经济高效的YB-1蛋白纯化方法;获得了质量较高的YB-1多抗,为进一步制备YB-1单抗、深入探讨其在肿瘤细胞中的生物学功能以及YB-1定量检测方法的建立奠定了基础。
- 李朴史静郭变琴钟梁梁勤东涂植光
- 关键词：YB-1
- Y盒结合蛋白1单克隆抗体的研制、表位测定及其免疫学应用被引量：5
- 2012年
- 建立稳定分泌抗人Y盒结合蛋白1单克隆抗体(anti-YB-1 mAb)的杂交瘤细胞株,鉴定其表位与免疫学应用。将重组YB-1蛋白免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合。经ELISA法筛选鉴定、定株后采用腹水诱生法制备anti-YB-1 mAb;Protein G亲和层析法纯化mAb,ELISA法测定mAb效价、亚型及相对亲和力。采用抗原表位预测法鉴定anti-YB-1 mAb识别表位所在区域。Western blot和免疫组化鉴定mAb识别内源性YB-1的特异性。经筛选鉴定获得2株稳定分泌anti-YB-1 mAb的杂交瘤细胞(1-D9,3-E8);腹水抗体效价均≥1×10-6,亚型均为IgGl;1-D9和3-E8单抗识别表位分别位于(134-160aa)与(266-303aa)肽段。Western blot、免疫组化结果证实anti-YB-1 mAb能特异性识别内源性YB-1。该研究为YB-1免疫学定性、定量检测方法的建立、肿瘤靶向抗体治疗及进一步探讨YB-1的生物学功能奠定了基础。
- 李朴史静成凤梁勤东匡文斌王秦董晋豫涂植光
- 关键词：YB-1单克隆抗体抗原表位免疫学检测
- 靶向YB-1的microRNA表达载体的构建及其对MB-MDA-231细胞增殖的影响被引量：1
- 2011年
- 目的:构建靶向YB-1基因的microRNA表达载体,研究其对乳腺癌细胞MB-MDA231增殖的影响。方法:采用microRNA靶基因预测软件预测可能作用于YB-1基因的micro RNA,构建其过表达载体,利用Lipofectamine2000转染细胞MB-MDA231,荧光显微镜下评估转染效果,real-time PCR检测microRNA137表达,real-time PCR、Western blot分别检测YB-1mRNA、蛋白水平的表达,双荧光酶素分析microRNA137作用位点,MTT检测MB-MDA231细胞转染后增殖情况;结果:酶切、测序结果表明pGensill-pre-mir137载体构建成功,real-time PCR结果表明pGensill-pre-mir137实验组细胞较对照组mir137表达明显增高(P<0.05);RT-PCR、Westernblot显示实验组转染后YB-1mRNA和蛋白水平表达较对照组均降低(P<0.05);双荧光素酶分析显示共转染microRNA137表达载体与荧光报告载体后,荧光素酶活性较对照组降低30%;MTT法检测显示转染实验组较对照组细胞增值能力降低(P<0.05)。结论:靶向YB-1基因的microRNAl37表达载体构建成功,microRNA137可通过靶向YB-1的3’非编码区,抑制MB-MDA231 YB-1基因的表达而影响其增殖。
- 孔飞飞邱欣欣陈光辉钟梁周义文成风匡文斌涂植光
- 关键词：YB-1增殖
- 靶向Y-box结合蛋白-1基因的shRNA质粒的构建及鉴定被引量：2
- 2011年
- 目的构建靶向Y-box结合蛋白-1(Y-box binding protein-1,YB-1)基因的短发夹RNA(shRNA)表达质粒并鉴定其抑制率。方法设计并合成3对针对YB-1基因的shRNA链,退火形成双链,与酶切的质粒pGenesil-1连接,构建3个重组质粒pGSi1、pGSi2和pGSi3,脂质体法转染人乳腺癌MDA-MB-231细胞,通过荧光定量PCR和Western blot分别检测细胞中YB-1基因mRNA的转录水平及蛋白的表达水平。结果重组质粒pGSi1、pGSi2和pGSi3经酶切及测序证明构建正确;转染MDA-MB-231细胞后,YB-1基因在mRNA和蛋白水平的表达均降低,其中pGSi2的抑制效果最好,在mRNA和蛋白水平的抑制率分别为57.4%和90%。结论成功构建了靶向YB-1基因的shRNA表达质粒,并筛选出1种对YB-1基因有显著抑制作用的shRNA,为进一步研究YB-1对乳腺癌细胞侵袭、迁移和多药耐药性的影响奠定了基础。
- 邱欣欣涂植光孔飞飞陈光辉匡文斌成凤钟梁
- 关键词：RNA干扰乳腺肿瘤
- hPSF蛋白的原核表达质粒的构建及分析鉴定
- 2012年
- 目的:构建hPSF蛋白原核表达质粒,在体外观察其与GAGE6调控区结合现象。方法:从人成纤维细胞中提取总RNA,利用hPSF特异性引物通过RT-PCR方法扩增hPSF cDNA编码序列,克隆入pET-28a载体中,构建重组载体pET-28-hPSF。将重组质粒转化入大肠埃希菌BL21(DE3)中进行表达,通过SDS-PAGE和免疫印迹法对表达产物进行鉴定。结果:酶切及测序结果显示,重组质粒构建成功;SDS-PAGE分析在相对分子质量约100kD处出现了1条蛋白条带,免疫印迹结果显示,所构建的重组载体可在大肠杆菌中高效表达hPSF蛋白。结论:成功构建了hPSF原核表达载体,并能够在大肠埃希菌中有效表达hPSF,为进一步研究hPSF的生物学作用奠定了基础。
- 夏乾峰李灵
- 关键词：肿瘤原核表达
- 人YB-1蛋白的高效原核表达、纯化及其多抗的制备被引量：10
- 2010年
- 目的构建YB-1原核表达系统,诱导表达后纯化YB-1融合蛋白并制备其多抗。方法采用RT-PCR扩增YB-1编码序列,将该序列克隆至载体pET-32a(+);转化BL21(DE3),确定最佳表达条件;采用亲和层析与超滤纯化目的蛋白,经Western blot鉴定后免疫家兔,制备其抗体。结果成功扩增YB-1编码序列并构建了其表达载体;SDS-PAGE结果显示,表达条件经优化后(28℃,5h,0.5mmol/LIPTG),YB-1融合蛋白在BL21中得到高效可溶性表达;Western blot结果证实,表达产物经纯化后获得了纯度较高的YB-1融合蛋白,将该蛋白免疫家兔后获得了效价与特异性较高的抗体。结论成功建立了YB-1蛋白的原核表达系统及蛋白纯化方法 ,并制备了其抗体。
- 李朴孔飞飞余雪梅成凤涂植光
- 关键词：YB-1原核表达
- 新型二聚体突变荧光引物定量检测沙眼衣原体被引量：1
- 2011年
- 目的以二聚体突变荧光引物技术为基础建立对沙眼衣原体进行定量检测的新方法。方法以沙眼衣原体主要外膜蛋白(MOMP)基因构建重组质粒作为DNA标准品,设计二聚体突变荧光引物,优化定量PCR体系并进行性能评价;同时对148例临床生殖道标本进行检测。结果建立的二聚体突变荧光引物的定量PCR方法,其线性范围为101～109 copies/μL,灵敏度为10 copies/μL;低浓度样品的批内变异系数(CV)为4.71%,批间CV为5.57%;高浓度样品的批内CV为3.20%,批间CV为3.66%;常见生殖道病原菌检测结果均为阴性;对确诊的148例患者标本检测准确率为99.32%。结论建立的沙眼衣原体定量PCR检测方法具有快速、准确、结果可靠等特点,可为沙眼衣原体感染的诊断、治疗监测和流行病学调查提供较好的技术支持。
- 夏乾峰覃西钱士匀涂植光
- 关键词：沙眼衣原体实时定量PCR
