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腺相关病毒介导人骨形态发生蛋白7基因体外转染脂肪源性干细胞的研究被引量：4: 2006年; 目的构建人骨形态发生蛋白7(hBMP7)基因重组腺相关病毒载体并观察其在脂肪源性干细胞(ADAS cells)中的表达,为骨组织工程探索新的基因治疗方法和细胞来源。方法以pcDNA1．1／Amp-hBMP7质粒为模板扩增,将回收的PCR产物片段克隆入pUC18载体,获得重组质粒pUC18-hBMP7。双酶切质粒pUC18-hBMP7、pSNAV,回收的两片段转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,获得重组质粒PSNAV-hBMP7。用重组Ⅰ型单纯疱疹病毒HSV1-rc／△UL2感染BHK-21细胞,裂解细胞收获病毒液。采用“氯仿处理-PEG／NaCl沉淀-氯仿抽提”三个步骤分离浓缩和纯化,测定病毒滴度。培养大鼠ADAS cells,并检测细胞表面标记物。在体外分别转染rAAV2-hBMP7和rAAV2-GFP,流式细胞仪、Western-blot方法检测转染基因的表达。结果PCR、酶切鉴定以及测序分析表明,BMP7基因成功克隆入质粒pSNAV-hBMP7载体中,并在BHK21细胞中成功包装出具有感染活性的重组腺相关病毒载体rAAV2-hBMP7。早期对ADAS cells的转染效率可达90％, Western-Blot方法检测到第1周与第8周的转染组细胞均有蛋白水平的表达。结论成功构建了hBMP7基因重组腺相关病毒载体和培养出大鼠ADAS cells,rAAV2-hBMP7载体在体外可高效转染大鼠ADAS cells。; 康焱廖威明盛璞义张珑涓原向伟雷磊黄保丁; 关键词：腺相关病毒脂肪源性干细胞基因治疗

重组35型腺病毒介导人骨形成蛋白基因对脂肪源性干细胞的诱导分化被引量：3: 2007年; 目的在体外运用人骨形成蛋白7(human bone morphogenetic protein7,hBMP-7)基因重组35型腺病毒(recombinant adenovirus's containing fibers derived from B-group serotype35,rAd5/F35)诱导大鼠脂肪源性干细胞(adipose-derived adult stem cell,ADASC)向成骨细胞定向分化,为骨组织工程探索新的细胞来源。方法以pcDNA1.1/氨苄青霉素-hBMP-7质粒为模板扩增hBMP-7基因,将回收的PCR产物片段克隆入pDC316载体,获得重组质粒pDC316-hBMP-7。骨架质粒pBHG-fiber5/35和穿梭质粒pDC316-hBMP-7共转染293细胞,同源重组产生rAd5/F35-hBMP-7。同样的方法构建rAd5/F35-增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)。在体外分别转染大鼠ADASC并留置空白对照。观察细胞形态和生长情况,ELISA检测转染基因的转录和表达,检测钙结节和骨钙素等成骨细胞表型。结果PCR、酶切鉴定表明rAd5/F35-hBMP-7质粒构建正确。rAd5/F35-EGFP对大鼠ADASC中转染效率可达90%以上,hBMP-7基因存在于转染后的ADASC中并表达相应的蛋白,诱导组钙结节形成,电镜见胞质中有钙质成分,碱性磷酸酶阳性,骨钙素表达增强。结论rAd5/F35介导hBMP-7基因可促进ADASC向成骨细胞定向分化。; 康焱廖威明袁振华张珑涓原向伟雷磊黄保丁; 关键词：腺病毒脂肪源性干细胞人骨形成蛋白基因治疗

人骨形态发生蛋白质7基因转染兔骨髓基质干细胞向成骨细胞的分化(英文)被引量：4: 2006年; 背景:骨形态发生蛋白质是目前发现惟一的一类具有成骨能力的细胞因子,它能刺激基质干细胞向成软骨细胞和成骨细胞方向分化。目的:应用基因工程方法,观察人骨形态发生蛋白质7基因转染兔骨髓基质干细胞向成骨细胞的定向分化。设计:单一样本观察。单位:中山大学附属第一医院骨科。材料:pcDNA1.1/AMP-hBMP7质粒。方法:实验于2004-05/2005-03在中山大学附属第一医院外科实验室完成。全骨髓培养法培养兔骨髓基质干细胞,在体外分别转染pcD-NA1.1/AMP-hBMP7和pcDNA1.1/AMP并留置空白对照。检测转染基因的转录和表达,观察细胞形态和生长情况,通过对感染细胞的碱性磷酸酶染色、钙盐染色、电镜观察胞质中钙质成分以及检测骨钙素鉴定其成骨分化表型。主要观察指标:①兔骨髓基质干细胞的形态及生长。②表达产物的鉴定。③碱性磷酸酶染色(钙钴法)结果。④茜素红染色结果。⑤透射电镜观察结果。⑥扫描电镜观察结果。⑦骨钙素的测定结果。结果:人骨形态发生蛋白质7基因存在于转染后的骨髓基质干细胞中并表达相应的mRNA。目的基因表达后的细胞形态略有变化,但生长曲线与未转染组无明显变化。骨钙素表达较未转染组明显增强。转染组细胞的碱性磷酸酶染色和钙盐染色均为阳性。结论:人骨形态发生蛋白质7基因转染可促进兔骨髓基质干细胞向成骨细胞表型分化。; 康焱廖威明盛蹼义张珑涓; 关键词：干细胞骨髓细胞骨形态发生蛋白质类

hBMP7瞬时转染对兔骨髓间充质干细胞生物学行为的影响被引量：2: 2006年; 【目的】运用人骨形成蛋白hBMP7(human bone morphogenetic protein-7,hBMP-7)基因体外转染兔骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs),观察瞬时转染对兔MSCs生物学行为的影响。【方法】密度梯度离心法培养兔MSCs,在体外分别转染pcDNA1.1/AMP-hBMP7和pcDNA1.1/AMP并留置空白对照。检测转染基因的转录和表达,观察细胞形态和生长情况,检测碱性磷酸酶、钙结节和骨钙素等成骨细胞表型。【结果】hBMP-7基因存在于转染后的骨髓间充质干细胞中并表达相应的mRNA。目的基因表达后细胞形态略有变化,生长曲线与耒诱导组无明显变化.钙结节形成,碱性磷酸酶增加,骨钙素表达增强。电镜见胞质中有钙质成分。【结论】hBMP-7基因可促进兔MSCs向成骨细胞表型转化。hBMP-7基因转染的MSCs有望成为组织工程化骨理想的种子细胞。; 康焱廖威明盛蹼义; 关键词：骨髓间充质干细胞骨形成蛋白

人骨形成蛋白7基因重组35型腺病毒载体的构建与鉴定被引量：1: 2008年; 目的探讨构建携带人骨形成蛋白7(human bone morphogenetic protein-7,hBMP-7)基因的重组35型腺病毒(serotype35adenovirus,Ad5F35)载体,为基因治疗研究提供一种新的方法,并观察其在兔骨髓间充质干细胞(MSCs)中的表达。方法以pcDNA1.1/Amp-hBMP7质粒为模板扩增骨形成蛋白(BMP-7)基因(1.3kb),将回收的PCR产物片段克隆入pDC316载体,获得重组质粒pDC316-hBMP7。骨架质粒pBHG-fiber5/35和穿梭质粒pDC316-hBMP7共转染293细胞,同源重组产生重组腺病毒rAd5/F35-hBMP7。同样的方法构建rAd5/F35-EGFP。在体外用不同感染复数(M.O.I)值的rAd5/F35-hBMP7和rAd5/F35-GFP分别转染兔MSCs,并留置空白对照。采用流式细胞仪、RT-PCR方法检测目的基因的转染效率和表达。结果PCR、酶切鉴定以及序列测定与比对分析表明,重组腺病毒rAd5/F35-hBMP7质粒构建正确。转染兔MSCs的最高效率可达99%,hBMP-7基因存在于转染后的MSCs中并表达相应的mRNA。结论本实验成功构建了含hBMP-7基因的重组腺病毒rAd5/F35-hBMP7载体,在体外能高效转染兔MSCs。; 康焱廖威明袁振华张珑涓原向伟雷磊; 关键词：骨形成蛋白腺病毒基因

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广东省科委重点攻关项目(C30307)

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