国家高技术研究发展计划(2012AA092203)
- 作品数：9 被引量：29H指数：3
- 相关作者：陈松林朱颖胡乔木谭训刚张培军更多>>
- 相关机构：中国水产科学研究院黄海水产研究所大连海洋大学中国科学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家高技术研究发展计划山东省“泰山学者”建设工程项目更多>>
- 相关领域：农业科学生物学环境科学与工程更多>>
- 半滑舌鳎vasa调控区的克隆、表达载体构建及其驱动活性检测被引量：2
- 2015年
- 为研究半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)vasa(Csvasa)基因调控区的功能,在已克隆的Csvasa基因编码序列的基础上,采用基因组步移和PCR扩增的方法克隆得到Csvasa调控区,通过生物信息学方法分析vasa基因5′区,并构建了含Csvasa基因调控区的绿色荧光蛋白(GFP)表达载体(p Csvasa-GFP-T),进一步通过显微注射技术初步验证调控区的驱动活性。结果表明,通过基因组步移和PCR扩增获得Csvasa 5′区5 166 bp和3′区1 655 bp,利用在线生物信息学软件对5′区序列进行分析,发现在转录起始点上游26 bp处存在保守的TATA框,以及潜在的转录因子结合点如SRY、Oct-1、Sox-5、CREB、GATA、AP-1、C/EBP、Sp-1、c-Myc、HNF、NKX2-5、V-Myb等。通过显微注射技术,将所构建的p Csvasa-GFP-T表达载体注射于青鳉(Oryzias latipes)受精卵并进行培养观测,发现Csvasa调控区能够驱动GFP在青鳉胚胎内表达,荧光表达率为81%。将有荧光的胚胎培养为成鱼,检测外源基因的整合率为11.5%。这些结果为进一步研究半滑舌鳎原始生殖细胞(PGCs)的标记、追踪和操作研究以及半滑舌鳎的性别控制等奠定了基础。
- 黄进强陈松林邵长伟刘洋林帆李亚亚王娜
- 关键词：半滑舌鳎显微注射
- 牙鲆NPY的体外表达及体内检测被引量：1
- 2014年
- 神经肽Y(Neuropeptide Y,NPY)被普遍认为是一种重要的促食因子,在调节鱼类的摄食行为方面起着至关重要的作用。为进一步研究牙鲆NPY蛋白的生物学功能,作者克隆了牙鲆NPY成熟肽序列(m-NPY)及含有信号肽的全长序列(f-NPY),利用原核表达系统分别进行体外重组表达,筛选出诱导剂IPTG最佳诱导浓度为0.8 mmol/L及最佳诱导时间3 h;此外,根据牙鲆NPY第49-64位氨基酸序列制备了多克隆抗体并通过Western blot验证该多抗能够有效检验重组NPY及牙鲆体内NPY的表达。研究结果为研究重组牙鲆NPY蛋白在牙鲆水产养殖产业中的应用及检测提供了依据。
- 王倩谭训刚孙威尤锋张培军
- 关键词：原核表达重组蛋白多克隆抗体
- 半滑舌鳎StAR基因克隆及其在不同组织的时空表达分析被引量：2
- 2014年
- 利用半滑舌鳎性腺转录组测序获得的StAR基因部分序列,设计RACE引物,克隆了半滑舌鳎StAR基因的cDNA序列,全长为1 294 bp,5'端UTR为132 bp,3'端UTR为310 bp,开放阅读框(ORF)为852 bp,共编码283个氨基酸。将半滑舌鳎StAR基因与其他物种StAR基因进行氨基酸同源性分析,结果显示,半滑舌鳎StAR与塞内加尔鳎、大口黑鲈、花鲈、金头鲷的同源性都达到了85%,与虹鳟、斜带石斑鱼及日本鳗鲡的同源性分别为81%、83%和76%。雌、雄鱼不同组织StAR基因的表达分析表明,StAR基因在雄鱼性腺中高表达,在雄鱼的肝脏、脑及心脏中表达量较低,而在雄鱼的其他组织中不表达;在雌鱼肠中不表达,在其他组织(卵巢、肝脏、脾脏、脑、垂体、肌肉、心脏、肾脏)中微量表达。荧光定量PCR分析不同组织与不同时期性腺表达谱表明,雄鱼性腺中StAR基因的表达量显著高于雌、雄鱼其他各组织(P<0.05),提示StAR基因对雄鱼精巢发育起重要作用。雄鱼不同时期表达谱分析结果显示,StAR基因在66天前的精巢中不表达,在150天时表达量急剧增加,至2龄时表达量最高,3龄时表达量下降,说明该基因在精巢发育成熟过程中起重要作用。原位杂交结果显示,StAR基因主要在雄鱼精巢的精子细胞中表达,而在雌鱼的卵巢中不表达。研究表明,StAR基因在半滑舌鳎精巢发育中发挥作用,且可能在精子形成中发挥重要作用。
- 朱颖孟亮胡乔木王晓夏常亚青陈松林
- 关键词：半滑舌鳎克隆实时荧光定量PCR原位杂交
- 磁珠富集法随机筛选大菱鲆基因组SNP标记被引量：1
- 2013年
- 利用磁珠富集法随机筛选了大菱鲆(Scophthalmus maximus)基因组7820bp的序列,获得了35个SNP标记,SNP标记的含量约为0.448%。超过68%的SNP标记由碱基转换造成,不足29%的SNP标记由碱基的颠换造成。使用磁珠富集法对目的基因KC70的检测发现,725bp的片段上发现7个SNP标记。此结果证实,该方法不仅能够随机筛选基因组SNP标记,还能筛选目的基因的SNP标记。
- 董晓丽徐建勇陈松林
- 关键词：SNPBST大菱鲆
- 牙鲆RAG2基因的质粒构建和体外原核表达
- 2012年
- 将牙鲆(Paralichthys olivaceus)RAG2 cDNA序列插入到体外表达质粒pProEXTM HT,在大肠杆菌(Escherichia coli)BL-21中进行体外表达,分析了诱导时间和IPTG浓度对重组蛋白产生量的影响,确定了最佳诱导条件为:诱导时间为3 h,IPTG诱导浓度0.2 mmol/L。本研究同时对RAG2重组蛋白的可溶性进行确认,并利用BD TALONTM金属亲和柱纯化了RAG2蛋白。本研究结果为进一步深入研究RAG2蛋白的生物学功能奠定了良好的基础。
- 王先磊谭训刚张培军徐永立
- 关键词：纯化
- 半滑舌鳎Dmrt1蛋白表达、纯化及功能被引量：6
- 2013年
- 通过分析半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）Dmrtl重组蛋白注射卵巢后基因表达调控，探讨Dmrtl在半滑舌鳎性别决定与分化中的功能。实验利用原核表达系统（Pet-32a）对半滑舌鳎Dmrtl基因进行重组表达，并通过亲和层析纯化获得了重组目的蛋白（Pet-32-dmrtl）。重组蛋白注射卵巢后实时定量PCR分析结果显示，Cypl9a和Foxl2在6～24h内两基因表达量均显著下调，Sox9a基因表达量在6～24h内有显著上调，但48h后3个基因的表达量逐渐恢复正常表达水平。研究结果证实，Dmrtl重组蛋白具有生物活性，且对性别相关基因表达调控具有一定的影响，在性别决定中发挥一定作用。
- 胡乔木王凯琳陈松林
- 关键词：半滑舌鳎DMRT1蛋白表达性别决定
- 半滑舌鳎抗缪勒氏管激素(AMH)基因的克隆及组织表达分析被引量：13
- 2013年
- 本研究克隆了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)AMH基因并对其进行表达分析。该基因cDNA序列开放阅读框长为1 563 bp,编码蛋白含520个氨基酸。该蛋白含有TGF-β超家族的特征序列,包含1个AMH-N区域和TGF-β结构域,并在C端生物活性区含有9个保守的半胱氨酸残基。系统进化分析表明,半滑舌鳎AMH和所有鱼类AMH聚为一簇,与鲽形目相似性最高。实时定量结果表明,AMH基因在半滑舌鳎不同组织中有差异表达,在正常雄鱼和伪雄鱼性腺中表达量最高。胚后不同时期性腺的实时定量结果表明,性腺分化之前AMH在精巢中相对表达量较低,70 dph(days post hatching)达到最高峰,而在卵巢中呈现先升高后下降的趋势,预示AMH基因可能在半滑舌鳎性腺发育中起重要作用。较正常雄鱼后代而言,AMH基因在伪雄鱼后代的雄鱼和伪雄鱼性腺中的表达都有升高的趋势,而在雌鱼中无明显差异,也预示其可能参与半滑舌鳎的性反转过程。
- 刘姗姗孙冰梁卓张静陈松林
- 关键词：半滑舌鳎克隆
- 半滑舌鳎WT1a基因的克隆与性别分化期的表达分析被引量：7
- 2014年
- 从半滑舌鳎（Cynoglossussemilaevis）全基因组序列中获得肿瘤抑制基因WT1a的部分序列，然后利用RACE技术克隆了WT1a基因的全长，运用组织学方法，对半滑舌鳎性腺分化早期的组织切片进行了观察，并分析了该阶段WTla的表达特征。克隆结果显示，WTla基因cDNA全长为1886bp，开放阅读框（ORF）长为1470bp，编码490个氨基酸，并且包含KTS三肽，5-UTR和3-UTR分别长为245bp和171bp。在ORF末端发现2个微卫星（SSR）序列和2个跨膜螺旋区域，而在其他物种中未发现这些区域。氨基酸序列分析显示，WT1a基因的保守性很高，与人的同源性高达90％。通过组织切片观察发现，该批半滑舌鳎在56d时性腺开始分化，并且卵巢分化早于精巢。荧光实时定量分析结果显示，WT1a在半滑舌鳎成鱼性腺中表达量显著高于其他各组织，在肝、肾、脾、心脏等组织中有微量表达，并且在成鱼性腺中，雄鱼表达量显著高于雌鱼，雌鱼显著高于伪雄鱼。在胚胎发育各时期以及初出膜后WTla的表达结果显示，在12h（原肠早期）显著升高，20h（神经胚期）达到最高。在性腺分化早期雌雄性腺中的表达结果显示，WT1a在雌雄半滑舌鳎16-66d的性腺中表达量持续平稳升高，在性腺分化时期表达量并没有特殊的变化。这些研究结果说明，WT1a基因是半滑舌鳎性别相关基因，并在半滑舌鳎的性腺分化、发育过程中持续表达，但可能对性腺的分化过程并不起决定作用。
- 张红陈松林刘洋温海深朱颖
- 关键词：半滑舌鳎实时荧光定量PCR
- 牙鲆Lhx1基因的克隆和表达分析
- 2013年
- Lhx1基因对于哺乳动物卵巢缪勒氏管的形成具有重要作用,但鱼类中的报道仅限于其在体轴和肾脏形成中的作用,尚未见到其与性别及性腺发育相关的报道。本研究克隆获得了牙鲆(Paralichthys olivaceus)Lhx1a和Lhx1b开放阅读框(ORF)序列,长度分别为1224 bp和1206 bp(GenBank注册号为:JX999940、JX999941),同源序列比较显示牙鲆Lhx1a和Lhx1b基因均具有两个LIM及一个HOX结构域,符合Lhx1进化保守性。这两个基因在牙鲆雌、雄成鱼各组织RT-PCR差异表达谱不尽相同,Lhx1a在精巢中弱表达,卵巢中不表达,在其他组织中雌、雄表达谱差异不大,都只在脑和眼组织有弱表达;而Lhx1b的表达在性腺中相对较高,且卵巢的表达量高于精巢。进一步检测牙鲆Lhx1a和Lhx1b在雌、雄性腺发育各期的表达谱,发现这两个基因表达集中于Ⅲ、Ⅳ期性腺,Lhx1a在精巢中弱表达,Lhx1b卵巢中的表达明显高于精巢,而在Ⅰ、Ⅱ、Ⅱ、Ⅴ期性腺几乎均不表达。由此推断牙鲆Lhx1a和Lhx1b均为性别相关基因,但在两性性腺发育中的作用可能各有不同。
- 翁申达尤锋范兆飞文爱韵王丽娟
- 关键词：RT-PCR
